Ndrg2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位研究.pdf

1、研究背景：
　　人NDRG2(N-myc downstream regulated gene2)基因是本室于1999年從正常成人全腦cDNA文庫(kù)中最先發(fā)現(xiàn)并克隆得到[1-2]。其染色體定位為14q11.2，含有16個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子；mRNA全長(zhǎng)為2,024nt，經(jīng)BLAST相似性分析證明所得序列為一新基因（GenBank檢索號(hào)：AF159092）。編碼357個(gè)氨基酸殘基、分子量約40kD的蛋白質(zhì)。初步研究顯示，該基因可表達(dá)于

2、多種組織中，并且是正常腦組織和膠質(zhì)瘤的差異表達(dá)基因。目前報(bào)道該家族成員有4個(gè)：NDRG1[3]、NDRG2、NDRG3和NDRG4[4]，其中NDRG4又分為三個(gè)亞型：NDRG4-B、NDRG4-Bvar和NDRG4-H。該家族各成員間的氨基酸殘基序列同源性很高，但在各組織間的表達(dá)水平有明顯差異。目前關(guān)于NDRG1及NDRG2的研究較為深入。研究表明，金屬化合物（Ni2+[3]、Co2+[5]）、低氧[5]、DNA損傷[6]、維生素D和

3、retinoids[7]、雄激素[8]、P53蛋白[6]等多種因素可引起NDRG1表達(dá)上調(diào)；而Myc蛋白[9]、VHL蛋白[10]、腫瘤發(fā)生及進(jìn)展[6]、細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境[6]等因素可下調(diào)NDRG1的表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在細(xì)胞的增殖分化[11]、脂質(zhì)的合成和代謝[12]、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[13]、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[14]等過(guò)程中，NDRG1發(fā)揮著重要作用。而NDRG2也有文獻(xiàn)報(bào)道參與了細(xì)胞分化[15]、細(xì)胞應(yīng)激[16]、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]

4、等過(guò)程。此外有人報(bào)道了在低氧條件下Ndrg1蛋白從細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象[6]。鑒于NDRG1和NDRG2在結(jié)構(gòu)上的相似性以及均被發(fā)現(xiàn)參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞應(yīng)激、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等事件，故推測(cè)兩者在功能上具有一定的相似性。本實(shí)驗(yàn)室由此研究了Ndrg2在細(xì)胞應(yīng)激條件下的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)Ndrg2在多種刺激條件下發(fā)生由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Ndrg2的氨基酸序列中不含有經(jīng)典的核定位信號(hào)序列[18]，故Ndrg2很可能通

5、過(guò)其他已知或未知的方式進(jìn)入細(xì)胞核。而對(duì)于Ndrg2在應(yīng)激條件下進(jìn)入細(xì)胞核現(xiàn)象的確認(rèn)以及入核可能機(jī)制的研究可以進(jìn)一步明確Ndrg2可能具有的功能，為后續(xù)的研究提供線索。
　　目的及內(nèi)容：
　　明確Ndrg2在多種細(xì)胞系中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位；檢測(cè)Ndrg2在多種細(xì)胞系中刺激條件下的亞細(xì)胞定位；建立Ndrg2在刺激條件下發(fā)生核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞模型。通過(guò)轉(zhuǎn)染截短的Ndrg2載體探索Ndrg2發(fā)生核轉(zhuǎn)位的可能機(jī)制。
　　方法：

6、　　1．收集31種人的細(xì)胞系，通過(guò)Western-blot檢測(cè)Ndrg2內(nèi)源性表達(dá)，選取表達(dá)量較高及細(xì)胞形態(tài)適合的細(xì)胞系通過(guò)間接免疫熒光的方法檢測(cè)在正常情況下Ndrg2蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　2．采用多種刺激條件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，一方面通過(guò)分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核亞組分進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)Ndrg2是否在給予刺激條件后進(jìn)入了細(xì)胞核；另一方面通過(guò)間接免疫熒光確認(rèn)Ndrg2在給予刺激條件后的亞細(xì)胞定位。
　　3．轉(zhuǎn)染外源性NDRG2，觀察

7、外源性Ndrg2蛋白在刺激條件下的定位情況。
　　結(jié)果：
　　1．明確了Ndrg2在31中細(xì)胞系中的表達(dá)情況。明確了在未給予任何刺激時(shí)，Ndrg2在多種細(xì)胞系中均定位于細(xì)胞質(zhì)。發(fā)現(xiàn)在在多種細(xì)胞系中，未給予任何刺激時(shí)Ndrg2與線粒體可能有共定位。
　　2．建立了Ndrg2在模擬低氧刺激條件下發(fā)生核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞模型：刺激條件為0.5mM和1.0mM的NiCl2刺激12h；細(xì)胞系為A549細(xì)胞和Bcap37細(xì)胞。
　　

8、3．成功構(gòu)建了重組的人pEGFP-C2-NDRG2真核表達(dá)載體。
　　4．通過(guò)轉(zhuǎn)染外源性NDRG2實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了在模擬低氧刺激條件下Ndrg2向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位。
　　5．在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了一持續(xù)存在的蛋白條帶，可能為NDRG2新的剪接變異體的翻譯產(chǎn)物，且此蛋白持續(xù)定位于細(xì)胞核中，通過(guò)生物信息學(xué)資料檢索及文獻(xiàn)閱讀，確認(rèn)可能的NDRG2新的剪接變異體的存在。構(gòu)建了此剪接變異體的EGFP融合表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的融合蛋白持續(xù)定位于