miR-181a通過激活mTOR信號通路參與學習記憶的形成.pdf

1、學習記憶的鞏固過程是將獲取的短時記憶轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時記憶的漸變過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，基因和蛋白信號通路的激活表達等過程都參與了記憶的鞏固過程。記憶獲得后的基因轉(zhuǎn)錄表達和蛋白合成對記憶的鞏固過程起到十分重要的作用。然而，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA有成千上萬種之多，這么多的miRNA是否都在學習記憶過程中發(fā)揮作用？不同的miRNA在學習記憶中發(fā)揮相同還是不同的作用？哪些miRNA參與海馬腦區(qū)的學習記憶過程？這一問題目前尚不清楚。
　　目的:

2、
　　探究在CFC(場景性恐懼記憶)記憶鞏固過程中發(fā)生內(nèi)在表達變化miRNA;通過特異性阻斷或過表達這些miRNA，在動物整體水平探究缺失或過表達特異的miRNA后對學習記憶鞏固過程的影響，明確這些miRNA在學習記憶過程中的功能，并探究其分子調(diào)控機制，確定其參與學習記憶鞏固過程所調(diào)控的靶基因或信號通路，為今后以特異性miRNA為靶點改善神經(jīng)退行性疾病所造成的記憶缺陷提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1. 探究在CFC訓

3、練后海馬腦區(qū)發(fā)生表達變化的miRNA
　　1.1 通過基因芯片分析CFC訓練后海馬腦區(qū)發(fā)生變化的miRNA
　　取8周大小的C57/BL6雄性小鼠，進行CFC訓練，在CFC訓練后1小時取海馬腦區(qū)，以單獨給予足底電擊刺激后1小時的海馬腦區(qū)為其對照，在杭州聯(lián)川生物有限公司進行基因芯片分析，對芯片結(jié)果中信號強度大于500的miRNA進行分析，找到在CFC訓練后發(fā)生顯著變化的miRNA。
　　1.2 RT-PCR驗證上述被篩選

4、出來的miRNA在CFC訓練后1小時的變化
　　我們將上述基因芯片篩選出來的所有miRNA進行RT-PCR的驗證，發(fā)現(xiàn)在CFC訓練1小時之后miR-181a，miR-126，miR-222，miR-143，miR-151a等miRNA水平上調(diào)，而miR-125，miR-690二者的水平下調(diào)。
　　1.3 海馬腦區(qū)特異性阻斷上述miRNA后檢測其對小鼠CFC學習記憶的影響
　　我們采用不同的antagomirs來特異性阻

5、斷相應的miRNA。我們在給小鼠海馬腦區(qū)分別注射miR-143和miR-181a的antagomirs之后，進行CFC訓練及測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬腦區(qū)miR-143被阻斷后對場景性恐懼記憶的獲得和鞏固過程均無影響;而阻斷miR-181a后小鼠場景性恐懼記憶的獲得并未受到影響，而鞏固過程則受到明顯損傷，這個實驗說明miR-181a參與小鼠CFC的鞏固過程，而miR-143則可能不參與。接下來，為了驗證其他有變化的miRNA在海馬依賴性學習記憶

6、中的功能，我們會繼續(xù)將不同miRNA的antagomirs注射進小鼠海馬腦區(qū)，進行CFC訓練和測試，觀察其是否對小鼠的學習記憶功能產(chǎn)生影響。
　　1.4 海馬腦區(qū)特異性過表達上述miRNA后對CFC學習記憶的影響
　　我們將采用慢病毒注射的方式在海馬腦區(qū)來特異性過表達不同的miRNA，在注射過表達慢病毒四周后進行CFC訓練和測試，觀察過表達miR-181a或其他miRNA能否對小鼠場景性恐懼記憶產(chǎn)生影響。
　　2. 探

7、究miR-181a及其他miRNA參與CFC記憶鞏固過程的調(diào)控機制
　　2.1 Luciferase reporter assay驗證miR-181a對PRKAA1和REDD1的調(diào)控
　　通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，miR-181a參與海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過程。miRNA在細胞中通常是作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子而存在，那么miR-181a究竟是通過調(diào)控何種靶基因來參與海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過程的呢？我們首先通過不同的軟件（Target

8、scan，miR-22，miRDB，microcosm）預測在細胞中可能受到miR-181a調(diào)控的靶基因，然后將每個軟件預測出的結(jié)果通過KEGG分析這些受miR-181a調(diào)控的靶基因所在的信號通路，最后將這四個軟件的KEGG分析結(jié)果取交集，縮小篩選范圍。通過這種方法，我們發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路中的PRKAA1和REDD1這兩個蛋白可能是受到miR-181a調(diào)控的靶基因。為了驗證我們的預測是否準確，我們將這幾個基因與miR-181a結(jié)合的3

9、'UTR區(qū)域連接到特殊的質(zhì)粒上，并將其種子序列進行了突變處理作為對照，然后分組進行Luciferase reporter assay實驗，驗證PRKAA1和REDD1在細胞中是否受到miR-181a的直接調(diào)控。
　　2.2 CFC訓練后miR-181a對PRKAA1和REDD1蛋白變化的調(diào)控
　　我們擬在CFC訓練之后0小時，1小時，2小時，4小時，8小時分別取材，檢測這兩個蛋白的表達水平。接下來，我們想通過在小鼠海馬腦區(qū)注

10、射antagomirs來特異性阻斷海馬腦區(qū)的miR-181a，然后再給予小鼠CFC訓練刺激，最后取出小鼠海馬腦區(qū)檢測在阻斷miR-181a后，CFC訓練刺激能否依然降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平。通過上述實驗，我們將判斷在CFC記憶過程中，miR-181a能否調(diào)控PRKAA1和REDD1這兩個靶蛋白。
　　2.3 miR-181a參與CFC記憶的鞏固過程依賴其靶基因PRKAA1和REDD1
　　為了更深入的研究miR

11、-181a能否調(diào)控靶基因PRKAA1和REDD1參與海馬CFC記憶的鞏固過程，我們將在行為學層次探究miR-181a參與海馬CFC記憶的鞏固是否依賴于PRKAA1和REDD1這兩個靶基因。
　　3. 探究miR-181a對mTOR信號通路的調(diào)控
　　我們首先擬在CFC之后不同時間點檢測mTOR蛋白的活性變化。接下來我們首先要探究海馬腦區(qū)miR-181a在CFC訓練后能否調(diào)控mTOR蛋白的活性。我們在小鼠海馬腦區(qū)注射miR-1

12、81a的antagomirs來阻斷miR-181a，然后對這些小鼠進行CFC訓練，訓練結(jié)束后4小時取出小鼠海馬腦區(qū)，檢測mTOR蛋白活性的變化，觀察阻斷miR-181a之后能否阻斷CFC訓練引起的mTOR蛋白活性升高，以此來觀察在CFC記憶鞏固過程中miR-181a能否調(diào)控mTOR蛋白的活性變化。
　　結(jié)果:
　　1. CFC訓練之后1小時海馬腦區(qū)miR-181a的表達升高
　　我們在CFC訓練后1小時和6小時取小鼠海

13、馬腦區(qū)，通過RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)，在CFC訓練后1小時，miR-181a表達顯著升高，而單獨給予環(huán)境暴露或足底電擊刺激并不能提高miR-181a的表達水平。
　　2. miR-181a參與調(diào)控小鼠CFC記憶的鞏固過程
　　我們將小鼠海馬腦區(qū)miR-181a阻斷后，進行CFC訓練和測試后發(fā)現(xiàn)，阻斷小鼠海馬腦區(qū)miR-181a并不影響小鼠CFC訓練和短時記憶，但損傷了小鼠CFC的長時記憶。相反，過表達miR-181a后，在低電流

14、刺激下，小鼠CFC記憶的鞏固過程顯著增強。隨后，我們發(fā)現(xiàn)，阻斷小鼠海馬腦區(qū)miR-181a并不影響小鼠的運動能力及焦慮樣行為。
　　3. miR-181a調(diào)控的靶基因篩選
　　我們首先采用Targetscan，miR-22，miRDB，microcosm這四種預測軟件預測miR-181a可能調(diào)控的靶基因。隨后采用KEGG分析方法，將每一種軟件預測出的眾多靶基因都用KEGG分析其所在的信號通路。最后將四種軟件的KEGG分析結(jié)果

15、取交集。我們發(fā)現(xiàn)所有預測出的信號通路中都包含mTOR信號通路。在mTOR信號通路中，PRKAA1和REDD1這兩個分子都被預測到可能受miR-181a的調(diào)控。我們通過luciferase reporter assay實驗驗證發(fā)現(xiàn)，PRKAA1和REDD1在細胞中受到miR-181a的調(diào)控，是miR-181a的靶基因。
　　4. PRKAA1和REDD1在CFC訓練之后的表達下調(diào)受到miR-181a的調(diào)控
　　我們?nèi)a(i)

16、ve以及CFC訓練后0小時，1小時，2小時，4小時和8小時小鼠的海馬腦區(qū)，檢測其中PRKAA1、REDD1和mTOR活性的變化情況。實驗結(jié)果表明，在CFC訓練后4小時，PRKAA1和REDD1的蛋白水平顯著下調(diào)，而mTOR活性水平顯著升高。當阻斷小鼠海馬腦區(qū)的miR-181a后，小鼠海馬腦區(qū)的PRKAA1和REDD1蛋白水平顯著提升，而CFC訓練刺激能夠顯著降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平;當阻斷miR-181a后再進行CFC訓練

17、刺激后小鼠海馬腦區(qū)的PRKAA1和REDD1蛋白水平則不再下調(diào)，而mTOR活性也不再升高。這個實驗說明，在CFC訓練后，小鼠海馬腦區(qū)的miR-181a能夠調(diào)控mTOR信號通路的蛋白變化。
　　實驗結(jié)論:
　　1. 通過本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)miR-181a參與了小鼠海馬腦區(qū)的CFC記憶的鞏固過程。
　　2. 通過軟件預測和luciferase reporter assay實驗驗證發(fā)現(xiàn)miR-181a能夠調(diào)控mTOR信號

18、通路中的兩個上游分子PRKAA1和REDD1。
　　3. 我們發(fā)現(xiàn)PRKAA1和REDD1能夠參與小鼠海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過程。
　　4. 我們確定了在小鼠海馬腦區(qū)CFC訓練過程中，上調(diào)的miR-181a能夠抑制靶蛋白PRKAA1和REDD1的表達，繼而激活mTOR蛋白，最終參與CFC記憶的鞏固過程。
　　5. 我們的實驗為進一步了解miRNA在學習記憶中的功能提供了理論基礎，為日后以miRNA為基礎治療臨床疾病提