曲美他嗪通過(guò)激活A(yù)MPK、ERK信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、缺血性心衰等造成的缺血性心臟病是臨床病人致死、致殘的重要病因。其中急性心肌梗死因其致死率高、預(yù)后差等因素受到格外關(guān)注。臨床上，急性心梗最重要的治療手段是盡快恢復(fù)受累血管的血供，如PCI介入治療、PTCA及靜脈溶栓。受累動(dòng)脈恢復(fù)供血的同時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)心肌損傷加重的現(xiàn)象，即心肌缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion injury I/R）。心肌缺血/再灌的機(jī)制復(fù)雜

2、，如胞內(nèi)鈣離子超載、氧自由基的產(chǎn)生、炎性細(xì)胞相互作用、細(xì)胞凋亡、及三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生減少等。
　　曲美他嗪可以改善穩(wěn)定性心絞痛病人靜息及運(yùn)動(dòng)時(shí)的缺血癥狀。在離體大鼠心臟中，曲美他嗪可穩(wěn)定心肌缺血時(shí)的PH。曲美他嗪可通過(guò)抑制脂肪酸代謝進(jìn)而激活丙酮酸氧化，減少乳酸及H+的堆積而調(diào)節(jié)心肌代謝。
　　AMPK是廣泛存在于真核細(xì)胞生物中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可以通過(guò)多種途徑激活,尤其是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生能量信號(hào)變化時(shí)。AMPK活化后

3、,可以加速分解代謝途徑如脂肪酸氧化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解等，抑制合成途徑如糖異生、蛋白質(zhì)合成、脂肪酸和膽固醇的合成,以降低能量消耗,維持能量的儲(chǔ)存。AMPK還可影響蛋白質(zhì)合成及分解、線粒體生成，因而在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　生理狀態(tài)下，AMPK激活后，可上調(diào)葡萄糖攝取，糖酵解，脂肪酸攝取，脂肪酸氧化,蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞自噬等過(guò)程。AMPK同時(shí)扮演著胞內(nèi)能量感受器的功能，在體內(nèi)ATP產(chǎn)生減少（如缺血，缺氧，糖供應(yīng)不足）

4、及消耗增多（如肌肉收縮）時(shí)，AMPK活化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。那么，曲美他嗪可以激活A(yù)MPK嗎？曲美他嗪是如何激活A(yù)MPK的？基于這些問(wèn)題，我們提出假設(shè)即：曲美他嗪通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。
　　研究目的：
　　探討曲美他嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　（1）在體實(shí)驗(yàn)組生化指標(biāo)檢測(cè)：選取20只12周C57BL6J小鼠，隨機(jī)分為4組（n=5）?；A(chǔ)對(duì)照組及基

5、礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)組：戊巴比妥（60mg/kg）腹腔麻醉滿意，小鼠靜息狀態(tài)下尾靜脈分別注射曲美他嗪（0.5mg/kg）及等量生理鹽水；對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組：開胸結(jié)扎前降支，造成缺血20min后，松開絲線恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，再灌注15min。再灌注前5min尾靜脈分別注射曲美他嗪（0.5mg/kg）及等量生理鹽水?；A(chǔ)組給藥后10min,手術(shù)組再灌后15min分別取心臟前降支供血區(qū)域（左室）做Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)P-Ampk、Ampk、P-AC

6、C、ACC、P-Akt、Akt、P-ERK、ERK的表達(dá)。
　?。?）在體實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積測(cè)量：選取40只12周C57BL6J小鼠，10只AMPK-KD轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為10組（n=5）:對(duì)照組，曲美他嗪實(shí)驗(yàn)組，AMPK-KD對(duì)照組，AMPK-KD+曲美他嗪組，Compund C對(duì)照組，Compund C+曲美他嗪組，PD98059對(duì)照組，PD98059+曲美他嗪組，Compund C+PD98059對(duì)照組，Compund C

7、+PD98059+曲美他嗪組。Compound C及PD98059缺血前30min腹腔注射以阻斷AMPK、ERK信號(hào)通路。開胸結(jié)扎前降支，造成缺血30min后，松開絲線恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，再灌注24h。再灌注前5min尾靜脈分別注射曲美他嗪（0.5mg/kg）或等量生理鹽水。采用TTC染色測(cè)量各組梗死面積；
　?。?）離體實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞收縮功能測(cè)量及胞內(nèi)ATP含量測(cè)定：選取5只12周C57BL6J小鼠，戊巴比妥麻醉滿意后取心臟置于心

8、肌細(xì)胞分離裝置，分離心肌細(xì)胞，每只心臟將存活的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為四組：基礎(chǔ)對(duì)照組及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)組，缺氧/再灌（20min/30min）對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。采用SoftEdge MyoCam system儀器系統(tǒng)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能，每組約檢測(cè)30個(gè)心肌細(xì)胞。同時(shí)采用Sigma Aldrich公司ATP試劑盒測(cè)量心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量；
　?。?）離體工作心臟系統(tǒng)心肌葡萄糖及脂肪酸代謝測(cè)量：選取10只12周C57BL6J小鼠，10只AMPK-K

9、D轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為4組（n=5）:對(duì)照組，曲美他嗪實(shí)驗(yàn)組，AMPK-KD對(duì)照組，AMPK-KD+曲美他嗪組。戊巴比妥麻醉滿意后取心臟置于離體工作心臟裝置，主動(dòng)脈、肺靜脈插管后穩(wěn)定20min,基礎(chǔ)代謝20min后停止液體循環(huán)，模擬缺血環(huán)境，20min后恢復(fù)循環(huán)，模擬再灌注狀態(tài)30min，每5min取代謝緩沖液分析代謝情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　（1）與對(duì)照組相比，曲美他嗪可顯著激活A(yù)MPK及ERK信號(hào)通路（p<0.05，p

10、<0.05),實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌梗死面積顯著降低（p<0.05）。在AMPK-KD+曲美他嗪實(shí)驗(yàn)組，梗死面積沒(méi)有顯著差異（p＞0.05）；在PD98059+曲美他嗪實(shí)驗(yàn)組，梗死面積沒(méi)有顯著差異（p＞0.05）。
　?。?）與對(duì)照組相比，使用曲美他嗪后，心臟在再灌注期間，葡萄糖代謝增加，脂質(zhì)代謝降低（p<0.05)。在AMPK-KD+曲美他嗪實(shí)驗(yàn)組，代謝與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。
　　（3）與對(duì)照組相比，曲美他嗪可增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮