miR-195在膀胱癌中的抑癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、膀胱癌是臨床上常見的腫瘤之一.在我國，其發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中位居首位。盡管如此，我們對膀胱癌的發(fā)病機(jī)制尚缺乏全面和深入的了解。但可以肯定的是膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑的變化過程，其中許多基因發(fā)生了改變。microRNA作為一類新近發(fā)現(xiàn)的小分子(長度約22nt)非編碼RNA，其在強(qiáng)大的基因調(diào)控功能已經(jīng)不斷為人們所認(rèn)識。在膀胱癌中也存在microRNA的異常表達(dá)。microRNA可能在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著重

2、要的作用
　　目的：本研究以定量PCR的方法驗證了miR-195在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，并以獲得性功能實驗鑒定miR-195在膀胱癌細(xì)胞系T24中的生物學(xué)功能。同時，對所預(yù)測的miR-195作用靶點進(jìn)行了驗證。
　　方法：1.在16對配對的組織標(biāo)本中進(jìn)行miR-195的相對表達(dá)量檢測，并統(tǒng)計分析miR-195在膀胱癌及癌旁膀胱粘膜組織中的表達(dá)差異，以及miR-195表達(dá)量與膀胱癌不同組織病理分期及分級之間的關(guān)系；
　

3、　2.通過體外轉(zhuǎn)染miR-195 mimic的方式來進(jìn)行獲得性功能實驗。以CCK-8、平板克隆形成、活體成瘤、流式細(xì)胞周期和凋亡檢測、劃痕實驗以及Transwell小室遷移和侵襲來分析miR-195過表達(dá)對細(xì)胞增殖與侵襲的影響；
　　3.結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR-195靶基因的預(yù)測，并利用Western Blot等進(jìn)行靶蛋白表達(dá)量的驗證，同時利用熒光素酶報告系統(tǒng)對miR-195的作用的靶序列進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：1.收集的1

4、6例膀胱癌癌組織標(biāo)本中，有15例為面R-195相對低表達(dá)，占93.75％。癌組織中miR-195表達(dá)量平均約癌旁組織的1/4。肌層浸潤性膀胱癌與非肌層浸潤性膀胱癌以及高級別膀胱癌與低級別膀胱癌在miR-195的相對表達(dá)量的平均值有差異，但未能有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性意義。
　　2.膀胱癌細(xì)胞株T24同樣存在miR-195低表達(dá)，與永生化的膀胱移行上皮細(xì)胞株SV-HUC-1相比，T24中miR-195的表達(dá)量約為其1/4。
　　3.

5、通過對T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-195 mimic來過表達(dá)細(xì)胞中的miR-195，可以抑制其生長.其抑制率呈現(xiàn)時間與濃度依賴性，在50nMmiR-195mimic處理72小時后，其抑制率達(dá)到37％。流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)miR-195mimic處理可以誘導(dǎo)T24細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，50nM miR-195 mimic作用48小時后，T24細(xì)胞G1期的比例增加35％，而流式細(xì)胞凋亡檢測提示miR-195過表達(dá)并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-195過

6、表達(dá)可以抑制T24細(xì)胞體內(nèi)外克隆形成能力。體外平板克隆形成實驗顯示，miR-195過表達(dá)使T24細(xì)胞克隆形成率從17％降到8％。同時，miR-195過表達(dá)可抑制T24細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤。劃痕實驗、Transwell小室實驗提示miR-195過表達(dá)不能抑制T24細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　4.將序列比對程序分析結(jié)果與細(xì)胞表型變化相結(jié)合，預(yù)測miR-195可能的調(diào)控靶基因為CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6、E2F3。我

7、們在T24細(xì)胞中檢測到Cyclin D1、CDK4、CDK6和E2F3在miR-195過表達(dá)后在蛋白水平有下調(diào)。進(jìn)一步熒光素酶報告系統(tǒng)分析證實CDK4是miR-195的直接作用靶點，其3’-UTR中存在miR-195調(diào)控的作用序列。
　　結(jié)論：1.與正常組織相比，膀胱癌組織中miR-195的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下調(diào)。但是本研究未能提示miR-195表達(dá)量高低與膀胱癌的惡性程度相關(guān)。
　　2.過表達(dá)miR-195使得膀胱癌細(xì)胞T24