新的抑癌microRNA miR-520e的發(fā)現(xiàn)及其在肝癌中作用分子機制的研究.pdf

1、肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有十分密切的關系，乙肝病毒表達的X蛋白(hepatitis B virus Xprotein，HBx)具有重要的致癌作用。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，可作為癌基因或抑癌基因參

2、與腫瘤的病理過程，是當前國際研究的熱點。本論文首次發(fā)現(xiàn)并報道了在肝癌細胞中miRNA-520e(miR-520e)是一個新的抑癌microRNA，從以下三個方面對其進行了深入系統(tǒng)的研究，主要研究結果如下：
　　 第一部分：miR-520e對肝癌細胞生長的作用
　　 為了觀察miR-520e與肝癌的關系，首先檢測了miR-520e在肝癌細胞和臨床肝癌組織中的表達情況。實時定量PCR結果顯示，與正常肝細胞(L-O2和Chan

3、gliver)相比，miR-520e在肝癌細胞系(HepG2、H7402和MHCC-97L)中明顯低表達。同時，miR-520e在23例臨床肝癌組織中的表達水平顯著低于其癌旁肝組織。上述結果提示，miR-520e是一個潛在的抑癌miRNA。然后，我們對miR-520e下調的分子機制進行了研究。生物信息學分析結果顯示，在miR-520e DNA的上游調控區(qū)存在一個CpG島。應用甲基化特異性PCR和亞硫酸鹽測序PCR的方法證實，在肝癌細胞和

4、肝癌組織中miR-520e上游調控區(qū)CpG島存在超甲基化現(xiàn)象。進一步利用雙熒光報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，miR-520e的CpG島區(qū)具有啟動子活性。因此，miR-520e DNA超甲基化是導致miR-520e表達下調的原因之一。然后，我們對miR-520e與肝癌細胞增殖的關系進行了探討。應用MTT檢測、EdU摻入增殖分析和克隆形成等實驗方法，發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞轉染miR-520e和在正常肝細胞中轉染miR-520e抑制劑后，miR-520e具有抑制

5、肝癌細胞增殖的作用；裸鼠成瘤實驗結果顯示，轉染miR-520e后肝癌細胞HepG2的成瘤能力明顯下降；為了探討miR-520e是否具有潛在的治療作用，采用在接種肝癌細胞HepG2的荷瘤裸鼠的腫瘤組織內直接注射的方法，發(fā)現(xiàn)miR-520e可明顯抑制腫瘤的生長，表明miR-520e在肝癌治療中有潛在的應用價值。上述結果表明，miR-520e是一個新的抑癌miRNA。
　　 第二部分：miR-520e抑制肝癌細胞生長作用的分子機制

6、r>　　 通常miRNA通過其靶基因實現(xiàn)功能，為了闡明miR-520e抑制肝癌細胞生長作用的分子機制，我們對miR-520e的靶基因進行了探討。運用生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)，核因子κB誘導激酶(NF-κB-inducing kinase，NIK)；是miR-520e的一個潛在靶基因。利用雙熒光報告基因、RT-PCR、real-time PCR和免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，miR-520e可以直接靶向NIK的3UTR區(qū)域，從而抑制其翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，

7、NIK在肝癌細胞系(HepG2，H7402和MHCC-97L)中和23例臨床肝癌組織中呈高表達，并且與miR-520e的表達呈明顯負相關，提示miR-520e可能通過其靶基因NIK發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞Chang liver中同時轉染miR-520e抑制劑和NIK的siRNA時，NIK siRNA可以逆轉miR-520e抑制劑導致的促進肝細胞生長的作用，支持了miR-520e可通過靶向NIK發(fā)揮抑制肝細胞生長的作用。進一步研究

8、表明，在肝癌細胞中NIK激活ERK1/2進而促進NF-κB的轉錄和入核。因此，miR-520e可通過抑制NIK-ERK1/2-NF-κB信號轉導通路發(fā)揮抑癌功能。
　　 第三部分：miR-520e在HBx促進肝癌細胞增殖中的作用
　　 為了進一步驗證miR-520e具有抑癌作用，我們觀察了miR-520e在HBx致癌中的變化和意義。利用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，miR-520e在穩(wěn)定表達HBx的肝癌細胞系HepG2-X和穩(wěn)

9、定表達HBx肝細胞系L-O2-X中均呈下調表達。應用RNA干擾沉默HBx mRNA的表達，可導致miR-520e的表達水平上調，提示miR-520e參與了HBx的促肝癌細胞增殖作用。應用MTT檢測發(fā)現(xiàn)，在HepG2-X肝癌細胞系和L-O2-X肝細胞系中過表達miR-520e，可阻斷HBx的促肝癌細胞增殖的作用。應用生物信息學方法進行分析，結果顯示絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(mitogen-activated protein kinas

10、e kinase kinase2，MEKK2)miR-520e的一個潛在的靶基因。雙熒光報告基因檢測結果表明，miR-520e可以直接靶向MEKK2的3'UTR區(qū)域。RT-PCR和免疫印跡實驗結果顯示，miR-520e可以顯著抑制MEKK2 mRNA和蛋白的表達水平，進一步證實了MEKK2是miR-520e的直接靶基因。為了進一步探討MEKK2是否參與miR-520e對肝癌細胞增殖的抑制作用，在轉染miR-520e抑制劑的肝癌細胞中干擾

11、MEKK2，發(fā)現(xiàn)MEKK2可明顯阻斷miR-520e抑制肝癌細胞增殖的作用。上述結果表明，HBx通過抑制miR-520e促進肝癌細胞的增殖，miR-520e通過其靶向MEKK2發(fā)揮作用。
　　 綜上所述，本研究首次報道m(xù)iRNA-520e是一個新的抑癌miRNA，通過其靶基因NIK抑制肝癌的增殖作用；miRNA-520e通過其靶基因MEKK2參與了HBx的致癌過程，進一步豐富了HBx致癌的分子機制研究。miRNA-520e抑制肝