MicroRNA-184在腎細胞癌中低表達的作用及其機制的研究.pdf

1、腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)原發(fā)于腎小管上皮(renal tubule epidermis)，是成人泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)中僅次于膀胱癌，腎細胞癌的生物學行為及其特征較為復雜，其發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全明確，約有1/3的患者初次就診時已有不同程度的擴散或轉移，約1/3的局限性腎癌患者手術切除腫瘤后仍會出現(xiàn)遠處轉移，腎癌傳統(tǒng)放化療的效果均不理想，一旦發(fā)生轉移，患者的5年生存率小于10

2、％，2年生存率小于20％。因此，探索腎癌的發(fā)生發(fā)展分子機制，尋找有效的診斷、預后分子標志物及分子治療靶點，具有重要的意義。microRNAs是一類廣泛存在動植物細胞內的內源性非編碼基因，大小約21～25個堿基，對轉錄后的基因表達有重要的調控作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。當前研究顯示microRNAs對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及凋亡、侵襲等生物學行為具有調控作用，隨著對microRNAs的研究進一步深入，microRNAs有望成為腫瘤診斷、治

3、療及判斷預后的靶點及分子標志物。leng等研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-184在腎癌組織中的表達明顯低于癌旁正常腎組織，提示microRNA-184在腎癌中可能受到抑制，但未對其機制進行進一步研究。而在神經母細胞瘤中，已有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-184具有抑癌基因的作用。通過靶基因預測，我們發(fā)現(xiàn)microRNA-184的靶基因為蛋白激酶2(AKT2)，F(xiàn)oley等研究發(fā)現(xiàn)在神經母細胞瘤中，microRNA-184可以抑制AKT2，影響腫

4、瘤的發(fā)生發(fā)展。在此基礎上，本研究旨在探索microRNA-184對腎癌的作用及其分子機制。
　　本文主要從以下幾方面進行了論述。
　　第一部分 microRNA-184及AKT2在腎癌中的表達
　　目的：1 研究腎癌組織中的microRNA-184的表達水平。2 研究AKT2在腎癌組織中的表達水平。
　　方法：1 應用realtime-PCR的方法，檢測腎癌組織與其相應癌旁組織中microRNA-184的表達水平

5、。2 應用realtime-PCR的方法，檢測腎癌組織與其相應癌旁組織中AKT1、AKT2的表達水平。3 運用SPSS18.0軟件，采用x2檢驗分析microRNA-184與AKT2在腎癌組織中表達水平的相關性。
　　結果：1、腎癌組織中microRNA-184的表達顯著低于癌旁組織Real time-PCR的結果顯示:在新鮮的腎癌組織中，microRNA-184呈低表達水平，在相互配對的6對新鮮腎癌組織與癌旁組織中，microR

6、NA-184的表達水平顯著低于癌旁組織。2、腎癌組織中AKT2的表達顯著高于癌旁組織，AKT1的表達與癌旁組織中無明顯區(qū)別。Real time-PCR的結果顯示:在新鮮的腎癌組織中，AKT2的表達明顯高于配對的癌旁組織，而AKT1的表達在新鮮癌組織與癌旁組織中無明顯區(qū)別。3、在腎癌組織中，microRNA-184的表達水平高低與AKT2的表達水平高低具有相關性以x2檢驗統(tǒng)計分析12例新鮮腎癌標本的microRNA-184和AKT2的表達

7、水平，發(fā)現(xiàn)其具有相關性，概率P＜0.05。
　　結論:MicroRNA-184在腎癌中低表達,AKT2在腎癌中高表達
　　第二部分 microRNA-184對腎癌細胞中AKT2表達的作用。
　　目的：研究高表達microRNA-184對腎癌細胞中AKT2表達水平的影響，探討microRNA-184作用于腎癌細胞的分子機制。
　　方法1 采用逆轉錄病毒介導的轉染法構建穩(wěn)定高表達microRNA-184的腎癌細胞株。

8、2 采用realtime-PCR和免疫印跡法對高表達microRNA-184后腎癌細胞中AKT1、AKT2、p-AKT1、p-AKT2、PI3K的表達水平進行檢測，分析microRNA-184對腎癌細胞中AKT2的作用。
　　結果：1 上調microRNA-184可抑制AKT2的表達在穩(wěn)定高表達microRNA-184的實驗組中，AKT2的表達明顯高于轉染無意義片段的陰性對照組和單純腎癌細胞的空白對照組。2 上調microRNA-

9、184可抑制AKT2的活化在穩(wěn)定高表達microRNA-184的實驗組中，p-AKT2的表達明顯高于轉染無意義片段的陰性對照組和單純腎癌細胞的空白對照組，提示AKT2的活化受到抑制。
　　結論：1 microRNA-184可抑制AKT2的表達和活化。2 microRNA-184通過抑制PI3K/AKT信號通路，來影響腎癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分 microRNA-184對腎癌細胞生物學行為的影響。
　　目的：研究高表

10、達microRNA-184對腎癌細胞增殖能力的影響。研究高表達microRNA-184對腎癌細胞侵襲能力的影響。
　　方法：1 應用流式細胞儀法檢測高表達microRNA-184后，腎癌細胞的凋亡情況。2 應用MTT法檢測高表達microRNA-184后，腎癌細胞的生長情況。3 應用Transwell法檢測高表達microRNA-184后對腎癌細胞侵襲能力的影響。
　　結果：1 高表達microRNA-184可增加腎癌細胞的

11、凋亡。流式細胞儀檢測結果顯示，實驗組的右下象限細胞群和右上象限細胞群細胞總數(shù)明顯多于空白組和陰性對照組;陰性對照組和空白組腎癌細胞的凋亡情況無明顯差別，說明在高表達microRNA-184后，腎癌細胞的凋亡明顯增加，microRNA-184具有促進腎癌細胞凋亡的作用。2 高表達microRNA-184可抑制腎癌細胞的生長增殖。MTT法檢測細胞生長曲線，結果顯示，隨著培育時間延長，實驗組（高表達microRNA-184腎癌細胞）的細胞生長

12、速度明顯低于空白組（腎癌細胞）和陰性對照組（轉染無意義片段的腎癌細胞）?？瞻捉M和陰性對照組的細胞生長情況無明顯區(qū)別。說明microRNA-184可以抑制腎癌細胞的增殖生長。3 高表達microRNA-184可抑制腎癌細胞的侵襲能力。Transwell檢測結果顯示，在實驗組（高表達microRNA-184腎癌細胞）中，侵襲入Transwell小室內的腎癌細胞個數(shù)明顯少于空白組（腎癌細胞）和陰性對照組（轉染無意義片段腎癌細胞），說明在高表達