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文檔簡介
1、皮膚鱗狀細(xì)胞癌(簡稱皮膚鱗癌)是我國常見的皮膚惡性腫瘤之一,容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),是導(dǎo)致非黑色素瘤皮膚癌患者死亡的主要病因。因此,尋找其發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子對鱗癌的診斷和治療是必不可少的。
微小RNA(microRNA或miRNA)是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼小RNA分子,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展密不可分。本課題主要研究miR-125b對皮膚鱗癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制,并對影響mi
2、R-125b表達(dá)的因素進(jìn)行初步探討。
本研究分為四部分進(jìn)行:
1.首先運(yùn)用低密度芯片檢測皮膚鱗癌組織中差異性表達(dá)的miRNAs,運(yùn)用實(shí)時定量PCR檢測miR-125b在皮膚鱗癌、光化性角化病和健康人皮膚組織以及不同分化程度的皮膚鱗癌組織中的表達(dá)。最后運(yùn)用原位雜交檢測皮膚鱗癌組織中miR-125b的表達(dá)水平。
2.運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將人工合成的miRNA前體轉(zhuǎn)染皮膚鱗癌UT-SCC-7和A431細(xì)
3、胞系,升高細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)水平,觀察細(xì)胞生長增殖、侵襲和遷移以及細(xì)胞凋亡的變化情況。
3.運(yùn)用芯片和生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-125b的潛在靶基因,并運(yùn)用熒光素酶報告基因系統(tǒng)、實(shí)時定量PCR和western印跡實(shí)驗(yàn)對靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。同時運(yùn)用實(shí)時定量PCR檢測皮膚鱗癌組織中靶基因的表達(dá),并分析靶基因與miR-125b表達(dá)水平的相關(guān)性。運(yùn)用RNA干擾技術(shù)敲降細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá),觀察細(xì)胞生長增殖、侵襲和遷移以及細(xì)胞凋
4、亡的變化情況。最后研究miR-125b下游調(diào)控可能涉及的分子機(jī)制,運(yùn)用實(shí)時定量PCR檢測miR-125b對下游基因的影響,闡述miR-125b在皮膚鱗癌細(xì)胞中可能參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
4.通過生物信息學(xué)方法對miR-125b的啟動子及其上游區(qū)域進(jìn)行分析,利用藥物5-aza對鱗癌細(xì)胞進(jìn)行處理,運(yùn)用實(shí)時定量PCR檢測藥物處理后細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá),探討miR-125b的表觀遺傳學(xué)改變。此外,利用KGF(角質(zhì)細(xì)胞生長因子)刺
5、激細(xì)胞,檢測miR-125b的表達(dá)是否受影響。
通過對本課題的研究,可以得到以下幾個結(jié)論:
1.miR-125b在皮膚鱗癌組織中低表達(dá),但是miR-125b可能與腫瘤的分化程度無關(guān)。
2.細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)升高后,造成細(xì)胞克隆形成能力降低、細(xì)胞周期G1/S進(jìn)程阻滯、細(xì)胞增殖減慢以及侵襲和遷移能力均降低,而細(xì)胞凋亡增加。
3.MMP-13和MAP2K7是miR-125b的直
6、接靶基因,miR-125b抑制MMP-13和MAP2K7的表達(dá);同時MMP-13和MAP2K7與miR-125b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。除此之外,TGFBR2、TP53INP1、MMP-7、cyclinD1和c-Jun等基因也受miR-125b的調(diào)控。敲降細(xì)胞內(nèi)MMP-13的表達(dá)后,細(xì)胞克隆形成、侵襲和遷移能力降低,但細(xì)胞的增殖和凋亡不受影響。敲降MAP2K7的表達(dá)后,細(xì)胞的增殖和克隆形成能力降低,細(xì)胞凋亡增加。通過對下游基因的分析,推測miR
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