WRAP53在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　食管鱗狀細(xì)胞癌惡性度高、預(yù)后差，食管癌發(fā)生、發(fā)展根本的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。近年來WRAP53(也被稱為TCAB1或WDR79)作為腫瘤抑制基因p53的反義基因引起人們的廣泛注意。最初對(duì)于 WRAP53的研究集中于其轉(zhuǎn)錄本對(duì)于正義基因 p53轉(zhuǎn)錄本的正向調(diào)控機(jī)制，同時(shí)證明了WRAP53敲除抑制DNA損害時(shí)P53的誘導(dǎo)。最近的研究則集中于其所編碼的蛋白質(zhì)的功能。WRAP53蛋白質(zhì)是活性端粒酶蛋白的新成員，對(duì)端粒酶全酶的

2、組裝、在Cajal小體的累積以及行使功能以確保端粒的延長(zhǎng)都是必須的。WRAP53蛋白能通過增加染色體末端端粒的長(zhǎng)度促進(jìn)祖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)多種癌細(xì)胞的生存。但WRAP53 mRNA和蛋白在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)及功能狀態(tài)尚未見報(bào)道，本研究的目的致力于闡明食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中WRAP53mRNA和蛋白的表達(dá)差異及其與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并對(duì)WRAP53表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響做一初

3、步研究。
　　方法:
　　1.運(yùn)用免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)分別檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(EC109， EC9706，KYSE150和KYSE180)、45對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌周正常食管粘膜上皮組織中WRAP53蛋白及WRAP53 mRNA的表達(dá)。
　　2.用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)115例食管癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織和85例癌周正常食管粘膜上皮組織（前面45對(duì)組織包括在內(nèi)）中的WRAP53蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量

4、測(cè)定，全面描述WRAP53在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌周正常食管粘膜上皮組織的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)合臨床資料進(jìn)行綜合分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　3.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將特異性siWRAP53作用于食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞使其WRAP53表達(dá)下調(diào)，MTT法用于檢測(cè) WRAP53表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株 EC109增殖的影響，免疫印跡法檢測(cè) WRAP53表達(dá)下調(diào)對(duì)凋亡蛋白BAX的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株 EC109凋亡率

5、的變化，證實(shí) WRAP53表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的作用，應(yīng)用細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物順鉑處理EC109，檢測(cè)WRAP53在RNA及蛋白水平的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(EC109，EC9706，KYSE150和KYSE180)均能檢測(cè)到WRAP53蛋白和mRNA的表達(dá)，但WRAP53蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量有明顯的不同，原始腫瘤外侵較深的KYSE150和KYSE18

6、0（T4）WRAP53的表達(dá)明顯高于原始腫瘤外侵較淺的EC109和EC9706（T3）；WRAP53蛋白和mRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中的表達(dá)較癌周正常粘膜上皮組織中的表達(dá)明顯升高(P＜0.001)。
　　2、免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示食管鱗狀細(xì)胞癌組織WRAP53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌周正常粘膜上皮組織(P<0.001)；食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌周正常粘膜上皮組織中WRAP53主要定位于細(xì)胞核上,顯示黃色或者棕黃色染色，食管鱗狀

7、細(xì)胞癌組織陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌周正常組織（包括癌周粘膜上皮組織、間質(zhì)組織、神經(jīng)組織、平滑肌組織等）；低分化的食管鱗狀細(xì)胞癌組織表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，可見核分裂象上染色；高分化的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，癌巢中間的角化珠特別是充分角化的腫瘤細(xì)胞呈陰性表達(dá)；癌巢周邊幼稚的腫瘤細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，癌巢中央成熟的腫瘤細(xì)胞則表達(dá)逐漸降低。癌周食管正常粘膜上皮組織陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，突出顯示為基底細(xì)胞和基底細(xì)胞層上方細(xì)胞核染色,上皮內(nèi)乳頭狀增生組織細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，鱗

8、狀上皮中層和表層呈陰性表達(dá)；WRAP53蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)程度,TNM臨床分期顯著正相關(guān)(P=0.001、P=0.007)，與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(P=0.026)，與年齡、性別、病理分化程度無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。
　　3、WRAP53表達(dá)下調(diào)能抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞的增殖，同時(shí)WRAP53表達(dá)下調(diào)能增加EC109細(xì)胞BAX蛋白的表達(dá)和EC109細(xì)胞的凋亡率，細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物順鉑能

9、在RNA和蛋白水平降低WRAP53的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.系統(tǒng)地證明了食管腫瘤組織及相應(yīng)正常組織中WRAP53蛋白和WRAP53mRNA的表達(dá)差異，WRAP53蛋白和WRAP53mRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)較癌周正常粘膜上皮組織中的表達(dá)上調(diào)。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果揭示了食管鱗狀細(xì)胞癌組織 WRAP53蛋白分布的特點(diǎn)：集中于細(xì)胞核，可能在基因水平上發(fā)揮生物學(xué)作用；與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，低分化高表

10、達(dá)的特征明顯，癌周食管正常粘膜上皮組織突出顯示為基底細(xì)胞和基底細(xì)胞層上方細(xì)胞核染色，在分化成熟癌巢中央和角化珠中的鱗癌細(xì)胞以及鱗狀上皮中層及表層細(xì)胞很低甚至呈陰性表達(dá)，提示了WRAP53與細(xì)胞增殖的相關(guān)性；WRAP53蛋白表達(dá)與食管癌原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)程度、臨床分期顯著正相關(guān)(P=0.001、P=0.007)，與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(P=0.026)，與年齡、性別、病理分化程度無明顯相關(guān)（P>0.05）。KYSE150和KYSE180的WRA

11、P53的表達(dá)明顯高于EC109和EC9706，進(jìn)一步確定WRAP53表達(dá)與食管癌原始腫瘤浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，WRAP53的表達(dá)升高可以作為判斷食管鱗狀細(xì)胞癌侵蝕、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。
　　3. WRAP53表達(dá)下調(diào)促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞的凋亡，促使凋亡蛋白BAX的表達(dá)升高，進(jìn)一步提示W(wǎng)RAP53表達(dá)的在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用。抗癌藥物順鉑能使WRAP53 mRNA和蛋白得表達(dá)下調(diào)，WRAP53有望成為一