miR--503在前列腺癌的抑癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:前列腺癌在目前男性腫瘤發(fā)病率里居第二位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)在2012年新發(fā)病例241740例，死亡病例28170例。我國(guó)近年來隨著PSA篩查的開展，其發(fā)病率也逐年上升。根據(jù)目前人們對(duì)前列腺癌的發(fā)病原因和進(jìn)展機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，除了常見的遺傳學(xué)因素，許多重要的分子事件是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的深層次原因。關(guān)于RNA的研究近年來受到了廣泛的關(guān)注，甚至被評(píng)為“十大科技突破之一”，而其中最引人注意的是microRNA(miRNA)。miRNA是

2、一類小分子非編碼RNA，作為一種重要的基因調(diào)控物質(zhì)，調(diào)控大約30％人類基因的轉(zhuǎn)錄，控制著細(xì)胞的分化、增殖和程序性細(xì)胞死亡等多種重要生理過程。大量證據(jù)表明，超過50％的人類miRNA基因與癌癥有關(guān)，其在多個(gè)不同類型的腫瘤及疾病中異常表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　目的:本研究首先通過測(cè)定miR-503在前列腺癌PC-3及DU-145細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并通過一系列功能實(shí)驗(yàn)研究了miR-503在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，然后

3、根據(jù)生物信息學(xué)知識(shí)，對(duì)miR-503潛在的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)并加以驗(yàn)證，并通過靶點(diǎn)分子的沉默和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miR-503對(duì)靶點(diǎn)的調(diào)控意義。
　　方法:1.檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞株中miR-503的表達(dá)量，并與前列腺正常上皮細(xì)胞株中miR-503的表達(dá)量進(jìn)行比較;并檢測(cè)CCND1在前列腺癌細(xì)胞及組織芯片中的表達(dá)情況，檢測(cè)TLN1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，證明CCND1及TLN1在前列腺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在差異表達(dá);
　　2.通過

4、體外轉(zhuǎn)染miR-503 mimic的方式使細(xì)胞呈現(xiàn)miR-503過表達(dá)趨勢(shì)以此進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞活力分析實(shí)驗(yàn)(CCK-8)、平板克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)以及Transwell實(shí)驗(yàn)，研究miR-503與的哪些細(xì)胞功能有關(guān);
　　3.使用在線生物信息學(xué)工具，預(yù)測(cè)并挑選潛在的miR-503靶基因，并通過構(gòu)建熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，并利用Western Blot、RNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)靶向調(diào)控

5、關(guān)系。
　　結(jié)果:1.與前列腺正常上皮細(xì)胞株RWPE-1相比，在前列腺癌PC-3和DU-145細(xì)胞株中，miR-503均呈低表達(dá)，而CCND1及TLN1呈高表達(dá)。在組織芯片中，CCND1在癌組織較癌旁組織呈高表達(dá);
　　2.通過對(duì)PC-3和DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-503 mimic來過表達(dá)細(xì)胞中的miR-503，我們觀察到細(xì)胞的存活率明顯受到抑制，用50nM的mimic處理后，PC-3在處理48小時(shí)及72小時(shí)后抑制率分別

6、達(dá)到了26％和36％(p＜0.05)，而DU-145的抑制率在處理48小時(shí)及72小時(shí)后分別達(dá)到29％和38％(p＜0.05)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，miR-503過表達(dá)使PC-3細(xì)胞克隆形成率下降了36％，使DU-145細(xì)胞克隆形成率下降了19％。流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-503 mimic處理可以誘導(dǎo)PC-3和DU-145細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，50nM miR-503 mimic作用48小時(shí)后，PC-3和DU-145細(xì)胞G1期的比例分

7、別增加13％和12％，而流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)提示miR-503過表達(dá)并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外， Transwell小室實(shí)驗(yàn)則提示miR-503能顯著地影響細(xì)胞的侵襲和遷移行為。
　　3.根據(jù)生物信息學(xué)知識(shí)，我們預(yù)測(cè)miR-503的可能靶基因?yàn)镃CND1、TLN1。熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)和western實(shí)驗(yàn)證實(shí)CCND1是miR-503與周期相關(guān)的直接作用靶點(diǎn)，而TLN1是與侵襲遷移功能相關(guān)的直接作用靶點(diǎn)。對(duì)CCND1實(shí)施特異性沉默和過表達(dá)

8、進(jìn)一步證實(shí)了其在miR-503調(diào)控細(xì)胞周期過程中的作用;對(duì)TLN1實(shí)施特異性沉默進(jìn)一步驗(yàn)證了其在miR-503調(diào)控細(xì)胞侵襲遷移功能中的作用。
　　結(jié)論:1.miR-503在前列腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，而CCND1、TLN1則呈高表達(dá)。
　　2.過表達(dá)miR-503使得前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU-145發(fā)生細(xì)胞周期阻滯及增殖顯著抑制，并削弱了細(xì)胞的克隆形成能力。同時(shí)，還抑制了細(xì)胞的侵襲及遷移功能。
　　3.CCND1、TLN