BCG誘導(dǎo)形成的NETs在膀胱癌治療中作用機(jī)制的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　探討中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)（neutrophil extracelluar traps, NETs）對膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲的影響及NETs對外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）增殖、細(xì)胞因子表達(dá)的影響；探討NETs對小鼠膀胱腫瘤生長及膀胱腫瘤中CD3表達(dá)的影響。
　　方法：
　　將卡介苗（BCG）與中性粒細(xì)胞共同培養(yǎng)4小時(shí)誘導(dǎo)NETs形成，制備NETs懸液；取不同濃度NETs與膀胱癌T24細(xì)胞共同培養(yǎng)，通過劃

2、痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)方法，分析NETs對膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲的影響；取不同濃度NETs與PBMCs共同培養(yǎng)，通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)及ELISA法，分析NETs對PBMCs增殖、PBMCs細(xì)胞表面CD4、CD8的表達(dá)和PBMCs分泌Th1型細(xì)胞因子TNF-α及IFN-γ的水平。建立Balb/c小鼠皮下膀胱腫瘤模型，將BCG誘導(dǎo)形成的NETs懸液皮下注射，同時(shí)設(shè)立陰性對照組，觀察小鼠的一般狀況和腫瘤生長情況；摘取腫瘤，對

3、腫瘤組織標(biāo)本行HE染色，觀察腫瘤病理情況；進(jìn)行CD3免疫組織化學(xué)染色，檢測膀胱腫瘤中免疫細(xì)胞的分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度NETs與膀胱癌T24細(xì)胞共同培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組（1×NETs組和2×NETs組）與對照組相比，膀胱癌T24細(xì)胞遷移能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2. Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度NETs與膀胱癌T24細(xì)胞

4、共同培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組（1×NETs組和2×NETs組）與對照組相比，膀胱癌T24細(xì)胞侵襲穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.不同濃度的NETs作用于PBMCs細(xì)胞后，NETs能夠明顯促進(jìn)PBMCs細(xì)胞增殖，隨著NETs濃度增加，PBMCs細(xì)胞增殖作用逐漸減弱。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組（0.5×NETs組及2×NETs組）PBMCs細(xì)胞CD4表達(dá)量與對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義（P＜0.05），0.5×NETs組與2×NETs組相比無明顯差異；PBMCs細(xì)胞CD8表達(dá)量各組之間均無明顯差異。
　　5.不同濃度NETs與PBMCs共同培養(yǎng)后，PBMCs細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)分泌TNF-α及IFN-γ的水平與對照組相比明顯增加，隨著NETs濃度增加，PBMCs細(xì)胞分泌TNF-α及IFN-γ的水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.在小鼠皮下注射NETs懸液14

6、天后，摘除腫瘤，NETs組小鼠皮下腫瘤體積和腫瘤重量均明顯小于陰性對照組；另外，HE染色病理結(jié)果顯示均為惡性腫瘤細(xì)胞；
　　7.免疫組化檢測結(jié)果顯示：NETs組腫瘤組織中CD3細(xì)胞陽性數(shù)較陰性對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1. BCG誘導(dǎo)形成的NETs在體外能夠抑制膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲作用。
　　2. NETs可以促進(jìn)PBMCs細(xì)胞的增殖作用，并能促進(jìn)PBMCs細(xì)胞表面CD