阻斷雌激素及其受體α信號對BCG治療膀胱癌的影響.pdf

1、目的：檢測不同的淺表性膀胱癌組織標(biāo)本中雌激素受體ERα的表達水平。探究雌激素及其受體抑制BCG療效的機制與淺表性膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)系。建立淺表性膀胱癌鼠模型，體內(nèi)驗證雌激素及其受體抑制BCG免疫治療效果的機制。
　　方法：
　　1.利用免疫組化的方法檢測相同分期分級復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)淺表性膀胱腫瘤中的雌激素受體ERα的表達水平并比較其差異。
　　2.細(xì)胞體外實驗部分，穩(wěn)定表達ERα的人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系T24及野生型人膀胱移行

2、細(xì)胞癌細(xì)胞系253J在37℃溫箱，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，利用蛋白印記技術(shù)（Western Blot）檢測ERα分別在兩種細(xì)胞系的表達情況。分別用雌二醇，雌二醇拮抗劑ICI182.780和TAM處理上述兩種細(xì)胞后，分別加入BCG，觀察細(xì)胞內(nèi)BCG及整合素蛋白α5β1的表達情況。探究雌激素影響B(tài)CG的粘附及進入細(xì)胞的過程的機制。另一部分細(xì)胞遵循上述處理之后，與人單核巨噬細(xì)胞系THP-1進行侵襲性實驗，驗證雌激素是否影響B(tài)CG對THP

3、-1細(xì)胞的募集來殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　3.動物實驗，采用N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine(OH-BBN)誘導(dǎo)FBV雌性小鼠20周后成瘤，分別分為對照組，實驗組，其中實驗組又分為單純BCG膀胱灌注組、單純雌激素拮抗劑及 BCG和雌激素拮抗劑膀胱灌注組，分別向?qū)嶒灲M各組老鼠膀胱內(nèi)灌注以上藥物,比較實驗組與對照組小鼠生存率，取瘤組織后，做病理切片，HE染色，同時檢測其中BrdU明確其增殖情況，檢

4、測F4/80明確其巨噬細(xì)胞浸潤情況。
　　結(jié)果：
　　雌激素受體α在術(shù)后復(fù)發(fā)的淺表性膀胱癌中的表達高于術(shù)后未復(fù)發(fā)的淺表性膀胱癌。
　　T24ERα細(xì)胞中的ERα蛋白的表達高于野生型T24細(xì)胞，253J細(xì)胞中的ERα蛋白表達極低；BCG粘附和進入膀胱癌細(xì)胞過程可以被雌二醇抑制；雌二醇抑制膀胱癌細(xì)胞整合素蛋白α5和β1的mRNA表達,相反雌激素拮抗劑ICI182.780促進膀胱癌細(xì)胞內(nèi)整合素蛋白α5和β1的mRNA表達；在

5、253J和T24ERα兩種膀胱癌細(xì)胞中證實整合素蛋白α5β1中和抗體可以抑制雌激素拮抗劑ICI182.780誘導(dǎo)的BCG與膀胱癌細(xì)胞粘附及進入膀胱癌細(xì)胞內(nèi)能力的增強；膀胱癌細(xì)胞經(jīng)不同處理后與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BCG刺激膀胱癌細(xì)胞后可以促進THP-1細(xì)胞的遷移，而雌二醇和BCG共同作用膀胱癌細(xì)胞后，THP-1細(xì)胞的遷移能力下降；采用不同的條件刺激T24ERα和253J細(xì)胞，即對照組、BCG組、E2+BCG組和E2+ICI182.7

6、80+BCG組，收集各組的條件培養(yǎng)基和膀胱癌細(xì)胞，檢測膀胱癌細(xì)胞中IL-6 mRNA水平與條件培養(yǎng)基中的IL-6蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCG刺激膀胱癌細(xì)胞可以導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞內(nèi)和分泌到細(xì)胞外的 IL-6水平升高；上述四組的條件培養(yǎng)基分別處理THP-1細(xì)胞，ELISA檢測不同條件培養(yǎng)基中TNFα的表達，顯示 ICI182.780+BCG組條件培養(yǎng)基中 TNFα的表達水平比單純 BCG組高，而E2+BCG組比單純 BCG組低；應(yīng)用上述四組條件培養(yǎng)

7、基處理 T24ERα和253J細(xì)胞，48小時后檢測細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示 THP-1+BCG+ICI182.780組中膀胱癌細(xì)胞活性最低。
　　HE染色顯示對照組和ICI182.780組出現(xiàn)乳頭狀瘤，BCG組出現(xiàn)膀胱尿路上皮非典型增生，BCG+ICI182.780灌注組膀胱尿路上皮基本正常；對照組表達 BrdU的膀胱尿路上皮細(xì)胞數(shù)目最多，ICI組與對照組相似，BCG+ICI182.780組表達BrdU的膀胱尿路上皮細(xì)胞數(shù)目最少，BC

8、G組比對照組和ICI182.780組表達BrdU的膀胱尿路上皮細(xì)胞數(shù)少，但比BCG+ICI182.780多；F4/80的陽性細(xì)胞數(shù)以BCG+ICI182.780組最多，BCG組次之、對照組和ICI組最少；不同處理組治療后，BCG+ICI182.780組小鼠生存時間最長，對照組和ICI182.780組小鼠生存時間最短。
　　結(jié)論：雌激素受體α在術(shù)后復(fù)發(fā)的表淺膀胱癌中的表達較高，雌二醇可以抑制BCG與腫瘤細(xì)胞的粘附及進入細(xì)胞從而影響B(tài)