使用抗雄激素藥物HF或ASC-J9_可以提高BCG的治療效果抑制膀胱癌的進展.pdf

1、目的：對于高危非肌層浸潤性膀胱（NMIBC）癌患者，卡介苗（BCG）膀胱灌注免疫治療一直是標準的一線治療方案，但是BCG免疫治療存在很多局限。最近有研究發(fā)現雄激素受體(AR)以及雄激素信號通路在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究試圖聯合應用BCG和抗雄激素藥物，通過細胞實驗和動物實驗來探討B(tài)CG和抗雄激素藥物聯用是否能夠更好的抑制膀胱癌的進展及其作用機制。
　　方法：⑴Western-Blot檢測T24細胞及253J細胞

2、中AR的表達水平；⑵設置各實驗組：單獨應用 BCG組，BCG聯合應用抗雄激素藥物羥基氟他胺（HF）組，BCG聯合應用雄激素降解劑二甲基姜黃素（ASC-J9?）組，分別用上述各組處理T24及253J細胞，用普通PCR法檢測膀胱癌細胞BCG的表達情況；用Q-PCR法檢測膀胱癌細胞整合蛋白α5、β1的mRNA的表達情況；⑶通過細胞遷移實驗驗證經過不同處理的（單獨應用BCG或與抗雄激素藥物聯用）膀胱癌細胞募集單核細胞 THP-1細胞的能力：將數

3、量大致相同的膀胱癌細胞鋪到Transwell的下室中，經過BCG或者BCG聯合抗雄激素藥物處理后，上室中加入數量大致相同的 THP-1細胞，培養(yǎng)2小時后收集下室培養(yǎng)基，計數其中的THP-1細胞數量作比較；將T24細胞及253J細胞做不同的處理后，檢測了膀胱癌細胞分泌的有關免疫反應的細胞因子，如 IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，CCL-2等的表達情況，對比產生的變化；⑷對THP-1細胞使用不同的實驗條件處理（單獨應用BCG或與抗

4、雄激素藥物聯用），通過Elisa檢測不同條件下THP-1細胞TNF-α的分泌情況；提取經過不同處理的THP-1的細胞培養(yǎng)基處理膀胱癌細胞系，使用MTT檢測膀胱癌細胞的生存能力差異。⑸根據血尿程度將小鼠隨機分為四組，分別是BCG組、ASC-J9?組、BCG+ASC-J9、對照組，每組十只。⑹通過不同實驗條件處理小鼠，處理完成后每組分別處死五只小鼠，取膀胱制成蠟塊，行HE染色觀察小鼠膀胱上皮細胞形態(tài)，行BrdU染色觀察小鼠膀胱上皮細胞增殖情

5、況，行F4/80免疫組化染色觀察巨噬細胞局部浸潤情況；⑺繼續(xù)飼養(yǎng)每組剩余五只小鼠，觀察其生存率的差異。
　　結果：①在T24細胞及253J細胞中，都有AR表達；使用5μM ASC-J9處理細胞后，AR的表達水平降低；②分別用不同條件處理T24及253J細胞后，用普通PCR法檢測膀胱癌細胞BCG的表達可見當BCG與HF或ASC-J9聯用后，膀胱癌細胞中BCG的表達有所升高，且升高將近2倍；使用Q-PCR檢測膀胱癌細胞中整合蛋白α5、

6、β1的mRNA的表達可見BCG與HF或ASC-J9聯用后，整合蛋白α5、β1的 mRNA的表達升高；③通過細胞遷移實驗可見，當 BCG與HF或ASC-J9?聯用處理膀胱癌細胞后，可以引起更多的THP-1細胞遷移向腫瘤細胞；使用Q-PCR檢測使用不同條件處理膀胱癌細胞后，相關免疫分子mRNA的表達情況，可見IL-6的表達在BCG與HF或ASC-J9聯用后升高，差異有統(tǒng)計學意義；④通過Elisa實驗可見，用BCG與HF或ASC-J9聯用處理

7、THP-1細胞后，可使THP-1細胞分泌更多的TNF-α；提取經過不同處理的THP-1細胞的培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)膀胱癌細胞，通過MTT可見BCG與HF或ASC-J9?聯用處理THP-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌細胞，可使膀胱癌細胞的生存能力明顯降低。⑤通過應用HE染色我們發(fā)現，對照組和 ASC-J9?組小鼠膀胱出現了尿路上皮乳頭狀癌和原位癌，BCG組小鼠膀胱切片可見少量的尿路上皮癌及少量的非典型增生，BCG+ASC-J9?組小鼠僅見少量的非典型增生

8、，很少發(fā)現膀胱癌細胞；⑥與BCG組及ASC-J9組相比，對照組表達BrdU的膀胱尿路上皮細胞數目最多，而BCG+ ASC-J9?組達BrdU的膀胱尿路上皮細胞數目最少；⑦與對照組相比， BCG組及 ASC-J9 F4/80陽性細胞數相對較多，而 BCG+ASC-J9組F4/80陽性細胞數目最多；⑧小鼠生存率：對照組小鼠平均生存31.12±2.28周；ASC-J9組小鼠平均生存31.83±2.36周，與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異；BCG組小

9、鼠平均生存35.64±2.73周，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義；BCG+ASC-J9組小鼠平均生存39.67±3.56周，與對照組相比有統(tǒng)計學意義。
　　結論：⑴與單獨應用BCG相比，羥基氟他胺（HF）或者ASC-J9?與BCG連用提高了BCG與腫瘤細胞的接觸、內化能力，從而更好地抑制腫瘤細胞生長；⑵羥基氟他胺（HF）或者ASC-J9治療增加了腫瘤細胞白介素6（IL-6）的釋放，從而可以募集更多的單核細胞/巨噬細胞，通過分泌更多的