雌激素受體α抑制膀胱侵襲.pdf

1、膀胱癌是第二常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。隨著年齡的增長(zhǎng)，男性和女性的發(fā)病率逐漸增加。男性發(fā)病率約為女性的三倍。在美國(guó)，2012年約50，000男性和17，000名女性患膀胱癌。對(duì)香煙及工作環(huán)境致癌物的過度暴露或泌尿系統(tǒng)感染可能引起男性高患病率。然而，即使在缺乏這些危險(xiǎn)因素的情況下，與性別有關(guān)的發(fā)病率的差異依然存在。因此，男女患者間的性激素及其受體的差異可能是膀胱癌發(fā)生率性別差異的潛在因素，然而有關(guān)此方面的證據(jù)仍較少。本研究分為四個(gè)部分：

2、
　　 第一部分：雌激素受體α(ERα)抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲。
　　 目的：探討ERα與膀胱癌細(xì)胞侵襲的關(guān)系。
　　 方法：首先穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERα或空載體質(zhì)粒(vector)進(jìn)入膀胱癌細(xì)胞。嘌呤霉素篩選5天后，免疫熒光測(cè)轉(zhuǎn)染效率。并收集蛋白，Western Blot進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)利用RNA干擾技術(shù)，選擇性的沉默人膀胱癌細(xì)胞株647v中ERα基因的表達(dá)。之后，使用3種ERα陰性膀胱癌細(xì)胞株（T24，UMUC3和

3、J82）和一種ERα陽(yáng)性膀胱癌細(xì)胞株(647v)進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。三維侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這些膀胱癌細(xì)胞株的侵襲能力。
　　 結(jié)果：⑴成功建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERα及shERα的膀胱癌細(xì)胞株。⑵采用Transwell系統(tǒng)研究ERα對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲的影響。在T24細(xì)胞中過表達(dá)ERα，抑制癌細(xì)胞的侵襲。用另外兩個(gè)膀胱癌細(xì)胞株UMUC3和J82進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果。另外，降低ERα在647v細(xì)胞的表達(dá)增加膀胱癌細(xì)胞的侵

4、襲。⑶相似的，采用三維侵襲實(shí)驗(yàn)，證明在UMUC3細(xì)胞過表達(dá)ERα抑制或敲除647v細(xì)胞中ERα增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的侵襲。
　　 結(jié)論：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和三維侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示ERα抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲。
　　 第二部分：ERα敲除鼠模型建立及ERα抑制膀胱癌侵襲。
　　 目的：建立雌激素受體α基因敲除鼠(ERαKO)模型并體內(nèi)研究ERα與膀胱癌侵襲的關(guān)系
　　 方法：建立ERαKO鼠需要兩代，我們首先交配ERαf

5、l/fl的雄性鼠與CMV-Cre轉(zhuǎn)基因雌性鼠，以獲得CMV-Cre/ERαfl/+鼠(F1)。再交配ERαfl/fl雄性鼠與 CMV-Cre/ERαfl/+雌性鼠(F1)，得到ERαfl/+(野生型，WT)和CMV-Cre/ERαfl/fl（ERαKO）鼠(F2)。自6周至18周，每日飲水中喂0.05％ N-丁基-N2（4-羥丁基）亞硝胺(BBN)以誘導(dǎo)膀胱癌發(fā)生。在28周（雄鼠）和38周（雌鼠）測(cè)血尿，30周（雄鼠）和40周（雌鼠）處

6、死鼠并取膀胱進(jìn)行H&E染色以比較腫瘤的侵襲性。在30周（雄鼠）和40周（雌鼠）觀察小鼠的生存率。運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組間的生存率差異。
　　 結(jié)果：⑴通過交配ERαfl/fl雄性鼠與CMV-Cre/ERαfl/+雌性鼠成功建立ERαKO鼠，基因型分析證實(shí)該鼠內(nèi)ERα基因缺失。⑵喂養(yǎng)0.05％BBN誘導(dǎo)WT鼠和ERαKO鼠發(fā)生膀胱癌。結(jié)果表明，相比WT鼠，ERαKO鼠有較嚴(yán)重的血尿。更重要的是，取膀胱組織進(jìn)行

7、H&E染色的組織學(xué)檢查顯示，ERαKO小鼠與野生型小鼠相比，更多進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性腫瘤。⑶Kaplan-Meier生存曲線顯示，ERαKO小鼠生存率顯著低于野生型小鼠。
　　 結(jié)論：BBN誘導(dǎo)膀胱癌后，相比WT鼠，ERαKO鼠腫瘤具有較高侵襲性且預(yù)后較差。
　　 第三部分：ERα調(diào)節(jié)IGF1、MMP2表達(dá)抑制膀胱癌侵襲。
　　 目的：ERα抑制膀胱癌侵襲的機(jī)制研究。
　　 方法：①首先穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERα或vec

8、tor進(jìn)入U(xiǎn)MUC3膀胱癌細(xì)胞，應(yīng)用qPCR檢測(cè)侵襲相關(guān)因子在兩組細(xì)胞中的表達(dá)差異。②應(yīng)用T24，647v細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果。③為研究篩選出的胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達(dá)，10 ng/ml IGF1處理UMUC3 ERα/vector細(xì)胞8小時(shí)，Western Blot檢測(cè)MMP2蛋白表達(dá)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞侵襲性。④50μM MMP2特異性抑制劑ARP-100處理647v shE

9、Rα細(xì)胞12小時(shí)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞侵襲性。⑤免疫組化檢測(cè)WT鼠和ERαKO鼠腫瘤中ERα、IGF1和MMP2表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴qPCR檢測(cè)侵襲相關(guān)因子，轉(zhuǎn)染ERα進(jìn)入U(xiǎn)MUC3膀胱癌細(xì)胞降低IGF1和 MMP2表達(dá)。⑵在T24細(xì)胞中，過表達(dá)ERα降低IGF1和MMP2表達(dá);647v細(xì)胞中，抑制ERα增強(qiáng)IGF1和MMP2表達(dá)。⑶IGF1處理UMUC3 ERα/vector細(xì)胞，MMP2表達(dá)增高。⑷IGF1處

10、理UMUC3 ERα細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)ERα對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲的抑制作用。⑸MMP2特異性抑制劑ARP-100處理647v shERα細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)shERα對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用。⑹ERαKO鼠無ERα表達(dá)，且相比WT鼠，腫瘤中IGF1和MMP2表達(dá)增高。
　　 結(jié)論：ERα通過下調(diào)IGF1進(jìn)而降低MMP2表達(dá)抑制膀胱癌的侵襲。
　　 第四部分：ERα激動(dòng)劑體外和體內(nèi)治療膀胱癌。
　　 目的：研究ERα激動(dòng)劑在體外和體內(nèi)

11、的治療效果。
　　 方法：①體外實(shí)驗(yàn)，10％活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清(CD-FBS)培養(yǎng)647v細(xì)胞3天，對(duì)照組DMSO處理，實(shí)驗(yàn)組10 nM ERα激動(dòng)劑丙基吡唑三醇(PPT)處理，24小時(shí)后進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。②體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，B6雌鼠(n=52)，自8周至20周，每日飲水中喂0.05％BBN誘導(dǎo)膀胱癌發(fā)生。52只小鼠隨機(jī)分為兩組，DMSO處理組及PPT治療組。自32周起，每?jī)扇?0μl的DMSO/PPT(210-

12、4M)腹腔注射。治療60天后處死小鼠并取膀胱組織，H&E染色以比較腫瘤的侵襲性。運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組間的生存率差異。
　　 結(jié)果：⑴相比于DMSO組，PPT處理后的647v細(xì)胞侵襲性減低。⑵體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果:H&E染色的組織學(xué)檢查顯示，DMSO處理組比PPT治療組鼠膀胱腫瘤更多進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性腫瘤。⑶Kaplan-Meier生存曲線顯示，PPT治療組小鼠生存率較好，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。