MDC1調(diào)控雌激素受體ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄并抑制乳腺癌增殖與侵襲.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈較快增長(zhǎng)趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨向年輕化[1]。盡管臨床研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)步，但是其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然很高。然而，乳腺癌的病因和發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全清楚，弄清病因和發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是目前迫切需要解決的問題，對(duì)其進(jìn)行更加廣泛和深入的研究有助于提高乳腺癌的診斷和治療的成功率。
　　雌激素受體ERα是核受體超家族成員之一，是一種配體依賴性活化的轉(zhuǎn)錄因子[6]。研

2、究證實(shí)正常乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ERα很少高表達(dá)，而在大約60％-80％的乳腺癌中ERα呈現(xiàn)高表達(dá)，而且ERα相關(guān)信號(hào)通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用[2-3]。許多ERα輔轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被鑒定參與乳腺癌的進(jìn)展。MDC1（也稱為NFBD1）在DNA發(fā)生損傷時(shí)可通過募集DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)DNA損傷后修復(fù)。MDC1基因缺陷小鼠會(huì)引起細(xì)胞染色體穩(wěn)定性降低，免疫缺陷，DNA修復(fù)缺陷等現(xiàn)象[30]。我們前期的研究表明MDC1參與調(diào)控雄

3、激素受體AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄并在前列腺癌中發(fā)揮抑癌作用，據(jù)此我們推測(cè)MDC1很可能與結(jié)構(gòu)相似并同屬于核受體家族的ERα相互作用，進(jìn)而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　在本研究中，我們的目標(biāo)是明確MDC1是否參與調(diào)節(jié)雌激素受體ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄以及MDC1是否影響乳腺癌的增殖和/或遷移，并試圖探索相關(guān)分子機(jī)制，為乳腺癌治療方法提供新的治療靶點(diǎn)及新思路。
　　方法:
　　一、MDC1在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達(dá)方式

4、　　1、Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDC1在乳腺癌癌旁組織及乳腺癌組織中表達(dá)水平。
　　二、ERα與MDC1在體內(nèi)外相互作用的驗(yàn)證
　　1、應(yīng)用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)確定ERα與MDC1在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　2、應(yīng)用共焦激光掃描顯微鏡觀察ERα與MDC1的定位及共定位。
　　三、MDC1調(diào)節(jié)ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄
　　1、應(yīng)用雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Dual-Luciferase Assay Sy

5、stem)檢測(cè)MDC1對(duì)ERα介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。
　　2、干擾MDC1表達(dá)檢測(cè)MDC1對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源ERα靶基因mRNA表達(dá)的影響。
　　四、MDC1調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移
　　1、構(gòu)建MDC1穩(wěn)定敲低乳腺癌細(xì)胞系。
　　2、應(yīng)用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDC1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDC1對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響。
　　4、荷瘤小鼠檢測(cè)MDC1是否在體內(nèi)影響乳腺癌

6、細(xì)胞成瘤及腫瘤生長(zhǎng)。
　　5、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDC1對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　一、MDC1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況
　　1、Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)MDC1在乳腺癌組織表達(dá)量低于癌旁正常組織
　　二、ERα與MDC1在體內(nèi)外相互作用的驗(yàn)證
　　1、ERα與MDC1在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　2、在E2存在情況下ERα與MDC1存在共定位。
　　三、MDC1

7、調(diào)節(jié)ERα介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄
　　1、在E2存在的情況下MDC1上調(diào)ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄
　　2.干擾MDC1表達(dá)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源ERα靶基因mRNA表達(dá)水平。
　　四、MDC1調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移
　　1、成功構(gòu)建MDC1穩(wěn)定敲低乳腺癌細(xì)胞系。
　　2、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低MDC1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)敲低MDC1明顯增強(qiáng)乳腺癌S期及G2/M期細(xì)胞。
　　4、荷