三氧化二砷對人乳腺癌雌激素受體表達的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 近年來乳腺癌的發(fā)病率和死亡率增長速度較快,全世界每年患乳腺癌的女性約130萬人,而死于乳腺癌的有50萬人。雖然我國的乳腺癌屬于低發(fā),但近年來其發(fā)病率增長幅度較快,預測20年后將會成為我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤。
　　 雌激素受體(estrogen receptor ER)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中,扮演著重要角色。在體內(nèi)通過與雌激素的結(jié)合,激活含雌激素應答元件基因和含有其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件基因的表達,進而

2、導致乳腺癌的發(fā)生。通常情況下,以ER基因表達情況的不同可將乳腺癌分為ER朋性乳腺癌和ER陽性乳腺癌兩種。其中ER陰性乳腺癌約占20％～35％,其惡性程度高、發(fā)展迅速、有較高的局部復發(fā)率,并易發(fā)生肺、肝、骨及腦等重要臟器的轉(zhuǎn)移,預后較差。由于缺乏相應的受體不能進行內(nèi)分泌和生物治療,所以這類特殊乳腺癌的治療僅限于化療,但療效欠佳。因此,作為一個分子標記物,ER在乳腺癌的內(nèi)分泌治療中進行效果預測、評估激素依賴性等方面具有重要的意義。
　

3、　 DNA甲基化和染色體重組是當前研究ER陰性乳腺癌中ER基因失活的兩大主要學說。甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用,但又是一可逆過程。從理論上來說,如果使用藥物對甲基化的抑癌基因和癌基因進行人為逆轉(zhuǎn),即可使因甲基化失活的基因重新獲得表達。
　　 三氧化二砷(As2O3)為中藥砒霜的主要成分,近年來發(fā)現(xiàn)其對白血病、原發(fā)性肝癌等多種腫瘤治療取得了較好的效果。主要通過誘導細胞凋亡來發(fā)揮其細胞毒性作用,如今多項研究證明其具有甲基

4、化抑制作用。
　　 本實驗通過研究不同濃度的As2O3對人ER陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-435進行藥物誘導,使其基因啟動子區(qū)CpG島部分脫甲基而使其重新表達有功能的ERα,從而使得ER陰性乳腺癌細胞恢復對內(nèi)分泌治療藥物的敏感性。
　　 材料與方法:
　　 (1)常規(guī)培養(yǎng)雌激素受體(ERα)陰性人乳腺癌細胞株MDA-MB-435,細胞濃度調(diào)整為5×105／ml后換含As2O3的培養(yǎng)液,至As2O3終濃度分別為0

5、.5μmol／L、1.0μmol／L、2.0μmol／L、4.0μmol／L,連續(xù)培養(yǎng)72h。以同期培養(yǎng)不加藥的MDA-MB-435細胞作為陰性對照,ERα陽性人乳腺癌細胞株MCF-7作為陽性對照。
　　 (2)RT-PCR方法檢測經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細胞ERα的mRNA表達情況。
　　 (3)甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)方法檢測經(jīng)不同濃度As

6、2O3處理后的MDA-MB-435細胞ERα DNA的5'-CpG島甲基化的情況。
　　 (4)Western blot方法檢測經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細胞ERα的蛋白表達情況。
　　 (5)免疫組化方法檢測經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細胞ERα的蛋白表達情況。
　　 (6)MTT方法檢測經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細胞,再經(jīng)三苯氧胺(TAM)處理,

7、觀察各組細胞的生長受抑情況。
　　 (7)統(tǒng)計學方法:應用統(tǒng)計學處理軟件SPSS16.0,X2檢驗進行統(tǒng)計學分析,差異顯著性標準設為P<0.05。
　　 結(jié)果:
　　 (1)RT-PCR法檢測陰性對照組無ERα mRNA基因；0.5μmol／L組未擴增出ERα mRNA基因;1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組均擴增出ERα mRNA基因。
　　 (2)甲基化特異性PCR法檢測

8、陰性對照組僅甲基化引物擴增出特異PCR條帶；0.5μmol／L組、1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組甲基化和去甲基化引物均擴增出特異PCR條帶。
　　 (3)經(jīng)Western blot檢測證實陰性對照組未顯示蛋白條帶；0.5μmol／L組也未顯示蛋白條帶,但1.0μmol／L組、2.0μmol／L和4.0μmol／L組顯示出蛋白條帶。
　　 (4)經(jīng)免疫組化法檢測證實陰性對照組細胞陽性率為7

9、.4％；0.5μmol／L組、1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組細胞陽性率分別為7.8％、43.8％、78.2％、41.5％。
　　 (5)MTT法檢測TAM作用于經(jīng)As2O3處理的MDA-MB-435細胞后,細胞增殖明顯受抑。陰性對照組受抑率為10.7％；0.5μmol／L組、1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組細胞受抑率分別是14.9％、30.7％、43.1％、56.