MiR-221沉默PUMA在膀胱癌免疫逃逸中作用與機制的實驗研究.pdf

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。本學位論文作者完全了解南昌大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論

2、文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權南昌大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編本學位論文。同時授權中國科學技術信息研究所和中國學術期刊(光盤版)電子雜志社將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數(shù)據庫》和《中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據庫》中全文發(fā)表，并通過網絡向社會公眾提供信息服務。(保密的學位論文在解密后適用本授權書)學位論文作者簽名(手馳鶘鋤簽名(手馳側簽字日

3、期：叫產多月7日簽字日期：乃夕年易月夕日I／摘要②陰性對照組(Negativecontr01)③控制組(Contr01)，用轉染試劑lipofectamineTM2000，將miR221抑制劑、NegmivecontrolFAM分別轉染T24、5637、J82細胞，采用MTT檢測轉染24h、48h、72h后細胞增殖活性，選取最優(yōu)轉染時間。轉染48h后，qRTPCR檢測miR221的表達；RTPCR、westernblot檢測miR221

4、靶基因PUMA及相關凋亡基因Bax、Bcl2的mRNA、蛋白表達水平；流式細胞術檢測細胞凋亡率的改變、AOEB染色檢測細胞凋亡的形態(tài)學改變。轉染48h后檢測細胞侵襲性改變。將人膀胱移行細胞癌T24、5637、J82細胞各分為①轉染miR221抑制劑組(TansfectionofmiR221inhibitor)②陰性對照組(Negmivecontr01)@控制組(Contr01)，分別轉染48h后，采用RTPCR、westemblot技術

5、檢測MMP9、MMP2、VEGFC的mRNA、蛋白的表達變化。用transwell檢測細胞侵襲性的改變。結果：1轉染miR221抑制劑促進人膀胱移行細胞癌T24、5637、J82細胞發(fā)生凋亡①用50I_tllip02000包裹100nMmiR221抑制劑或NegativecontrolFAM分別轉染T24、5637、J82細胞，5h后熒光顯微鏡下觀察結果示：轉染效率均接近80％，符合后續(xù)實驗要求。②轉染24h、48h、72h后，MTT結

6、果示：miR221抑制劑對3株細胞的實驗組細胞增殖活性均出現(xiàn)不同程度的降低，其抑制率也相應的升高，且具有時間依賴性，陰性對照組和控制組比較，細胞增殖活性和抑制率并無明顯變化：雖然轉染72h后，細胞抑制率高于48h，但轉染72h后，細胞量較少，難以滿足后續(xù)RNA、蛋白提取等實驗要求，故選轉染48h進行后續(xù)實驗。③轉染48h后，qRTPCR檢測miR221表達結果示：3株細胞實驗組miR221表達水平與陰性對照組、控制組比較明顯下調，差異具

7、有統(tǒng)計學意義(尸O05)，且J82細胞下調最為明顯，陰性對照組與控制組比較無明顯差異，此結果說明，轉染miR221抑制劑48h后，確實有效的抑制了3株細胞內miR221表達。④轉染48h后，RTPCR、westernblot結果示：3株細胞實驗組促凋亡基因PUMA、Bax的mRNA和蛋白表達與陰性對照組、控制組比較明顯上調，而抗凋亡基因Bcl2的mRNA和蛋白表達與陰性對照組、控制組比較明顯下調，差異均具有統(tǒng)計學意義(尸005)，陰性對