外周血miR-200c在膀胱癌中應(yīng)用價值初步研究.pdf

1、目的：
　　目前國內(nèi)外研究證實microRNAs異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生和實性腫物的進(jìn)展有關(guān)，miR-200s決定著腫瘤細(xì)胞的上皮表型并控制著腫瘤的侵襲性和遷移性。與傳統(tǒng)的從組織中獲取microRNAs相比，外周血中獲取microRNAs，具有更加微創(chuàng)，減輕取樣過程中病人的疼痛和術(shù)后反應(yīng)，大大縮短臨床采集樣本的時間，可同時得出多項與疾病有關(guān)的參數(shù)以及可反復(fù)操作、動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點。因此，我們假設(shè)定量檢測外周血中miR-200s中具有上皮特性

2、的microRNAs，可能作為膀胱癌一種有效的生物標(biāo)志物。
　　方法：
　　搜集國內(nèi)外文獻(xiàn)證實，miR-200s中miR-200c在膀胱癌和健康人群的膀胱組織中具有明顯差異，可作為膀胱癌診斷，惡性程度評估及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。本實驗共包含75例研究對象，所有研究對象均已了解外周血樣本采集意義并簽署知情同意書。實驗組為膀胱移行細(xì)胞癌患者，無其它腫瘤病史，共58例;對照組為隨機(jī)健康體檢者17例。實驗組術(shù)后均經(jīng)病理證實為膀胱移行

3、細(xì)胞癌。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的分化程度，按照WHO2004分級，分為:低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤(Papillary urothelial neoplasms of low malignant potential，PUNLMP)、乳頭狀尿路上皮癌低分級、乳頭狀尿路上皮癌高分級三個級別。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年第7版TNM分期法對膀胱癌進(jìn)行分期，分為Tis原位癌、Ta非浸潤性乳頭狀癌、T1腫瘤侵及上皮下結(jié)締組織、T2腫瘤侵犯肌層、

4、T3腫瘤侵犯膀胱周圍組織、T4侵犯以下任一器官或組織，如前列腺、子宮、陰道、盆壁和腹壁。非浸潤性膀胱癌包括Tis、Ta、T1，浸潤性膀胱癌包括T2、T3、T4。對照組將有明確膀胱癌或腫瘤家族史、腺性增生性膀胱炎、前列腺特異抗原(PSA)大于4.0ng/ml的前列腺增生患者、甲胎蛋白(AFP)大于400mg/ml、癌胚抗原(CEA)大于15.0ug/L等患者排除。同時收集58例實驗組中30例患者的組織樣本，包括腫物和正常黏膜組織，組織樣本

5、獲取前經(jīng)患者同意并再次簽署知情同意書。收集實驗對象的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、TNM分期、分級情況等，并以單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，檢驗miR-200c相對表達(dá)水平與各臨床病理因素之間的相關(guān)性。每例被研究者應(yīng)用DEPC管留取血標(biāo)本5ml，應(yīng)用EDTA抗凝，于4℃條件下1000r/min離心10min，收集血漿存于DEPC管中，立即投入到液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱中直到RNA分離;正常組織樣本取距腫瘤2.

6、5cm以上正常膀胱粘膜，組織樣本獲取后30min內(nèi)用錫紙包裹裝入冷凍管，液氮冷凍，-80℃保存。采用實時定量RT-PCR法檢測標(biāo)本中miR-200c含量，以TRIzol提取RNA，基因特異性頸環(huán)形逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄完成后，應(yīng)用SYBR→Premix Ex TaqTM熒光試劑進(jìn)行相對定量研究，以U6RNA為內(nèi)參，計算miR-200c相對表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS17.0 for windows統(tǒng)計軟件包，

7、以student t檢驗比較實驗組和對照組中以及實驗組中不同分期、分級的膀胱癌標(biāo)本中miR-200c相對表達(dá)水平差異，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。繪制ROC曲線，計算曲線下面積，評估其靈敏度、特異度和總符合率。
　　結(jié)果：
　　1.膀胱癌患者外周血中miR-200c表達(dá)水平與正常對照相比明顯升高(P=0.018)。
　　2.miR-200c的表達(dá)水平與TNM分期、分級情況存在相關(guān)性(P＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小

8、、腫瘤數(shù)目等各臨床病理參數(shù)之間無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。
　　3.血液樣本繪制ROC曲線，得出曲線下面積(AUC-ROC)是0.88。觀察到miR-200c診斷膀胱癌的靈敏度、特異度和總符合率分別為79.20％、77.30％及72.00％。
　　4.膀胱癌組織中與正常組織相比，miR-200c表達(dá)水平明顯升高，其診斷膀胱癌的靈敏度、特異度和總符合率分別為84.00％、82.90％及85.00％。
　　5.繪制一RO

9、C曲線，結(jié)果顯示血液和組織中miR-200c預(yù)測浸潤性腫瘤的靈敏度和特異度均為47.10％和83.30％，曲線下面積相同為0.64;預(yù)測高級別腫瘤的靈敏度和特異度均為68.60％和73.90％，曲線下面積相同為0.71。
　　結(jié)論：
　　1.外周血miR-200c表達(dá)水平與膀胱癌關(guān)系密切，與健康人群相比，異常高表達(dá)，即單個上皮和腫瘤表達(dá)的miR-200c血液水平能夠區(qū)分膀胱癌患者和健康對照組。
　　2.miRNA-20

10、0c的表達(dá)水平與T分期、病理分級相關(guān)，且在膀胱癌患者中，隨病理分級和臨床分期的增高，表達(dá)水平降低。提示miRNA-200c可能與膀胱癌的浸潤、轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。
　　3.miR-200c對膀胱癌診斷具有較高的靈敏度、特異度和總符合率，且組織中miR-200c的診斷性能要高于外周血。應(yīng)用外周血樣本具有方便獲取，減輕病人痛苦等獨特優(yōu)勢，但miR-200c在膀胱癌診斷及預(yù)后評估方面的應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。
　　4.膀胱癌腫瘤組織中mi