低密度脂蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞自噬及其信號機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　目前，有關(guān)脂蛋白與細(xì)胞自噬關(guān)系的研究主要集中在氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)，研究認(rèn)為ox-LDL可激活內(nèi)皮細(xì)胞自噬，而天然低密度脂蛋白對自噬的作用尚不清楚。本課題擬研究低密度脂蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。
　　方法：
　?。?）在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelia

2、l cells，HUVECs）中轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，使細(xì)胞過表達(dá)帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的微管相關(guān)蛋白輕鏈-3（Light chain-3,LC3），在有或無溶酶體抑制劑巴弗洛霉素（Bafilomycin,Baf）存在下，加入50μg/mL低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）作用60min，通過熒光顯微鏡察看自噬小體數(shù)量的改變。（2）用10μg/mL或50μg/mL LDL處理HUVECs60min，通

3、過Western blot觀察不同濃度LDL作用下LC3-II的改變及Akt和mTOR磷酸化的改變。（3）用50μg/mL LDL分別處理HUVECs5min，10min，30min或60min后，通過Western blot檢測LC3-II的改變及Akt和mTOR磷酸化的改變。（4）利用Akt上游分子PI3K的抑制劑LY294002預(yù)處理HUVECs，通過Western blot檢測LDL對PI3K/Akt信號通路的影響。（5）利用免

4、疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CoIP)及Western blot的方法探究胰島素受體(Insulin receptor,IR)與低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR)相互作用關(guān)系。（6）用50μg/mL LDL處理HUVECs5min，10min或30min，通過Western blot觀察IR，LDLR及GLUT1在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中表達(dá)量的改變。（7）用50μg/mL LDL與100nM I

5、nsulin共處理HUVECs，Western blot檢測二者聯(lián)合作用對PI3K/Akt信號通路，GLUT1在胞膜和胞漿中分布的影響，探究二者的作用是否存在競爭關(guān)系。（8）用小干擾RNA(Small interference RNA,siRNA)沉默HUVECs的胰島素受體后，通過Western blot觀察LDL對細(xì)胞自噬(LC3)及相應(yīng)信號通路（PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GSK3β）作用的改變。（9）采用熒光葡

6、萄糖類似物2-NBDG進(jìn)行細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)，觀察LDL對細(xì)胞攝取葡萄糖功能的影響及其與Insulin之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　?。?）熒光顯微鏡下，LDL(50μg/mL)引起LC3綠色熒光斑點(diǎn)即自噬小體的明顯減少；單獨(dú)阻斷溶酶體功能（Bafilomycin單獨(dú)作用）時(shí)，LC3綠點(diǎn)明顯堆積；阻斷溶酶體功能后，再加入50μg/mL LDL作用后自噬小體減少。（2）10μg/mL或50μg/mL LDL處理 HUVECs60

7、min后，LC3-II表達(dá)減少，Akt(Ser473)及mTOR(Ser2448)磷酸化增加，均呈濃度依賴性特征。（3）用50μg/mL LDL分別處理HUVECs5min，10min，30min或60min后，mTOR的磷酸化水平隨著時(shí)間推移而持續(xù)增加；Akt磷酸化程度在5min時(shí)達(dá)到最高，其后減弱，但到60min時(shí)依然高于對照組；LC3-II在30min和60min時(shí)明顯減少。（4）PI3K抑制劑LY294002(5μM)預(yù)處理HU

8、VECs后可明顯抑制50μg/mL LDL引起的Akt磷酸化增加，及LC3-II表達(dá)下降。（5）免疫共沉淀結(jié)果顯示IR與LDLR二者作用具有相互性的特征。（6）50μg/mL LDL作用5min時(shí)，HUVECs細(xì)胞膜上IR及LDLR的表達(dá)明顯減少，而胞漿內(nèi)IR及LDLR的表達(dá)顯著增加，其后跟著時(shí)間變化，含量慢慢回到基線程度；胞膜上GLUT1含量在5min時(shí)顯著上升，胞漿內(nèi)GLUT1含量變少。（7）單獨(dú)的 LDL（50μg/mL）或胰島素

9、（100nM）刺激均可激活PI3K/Akt/GSK3β和PI3k/Akt/mTOR通路，且使細(xì)胞漿內(nèi)GLUT1蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，前者效應(yīng)弱于后者，而先用LDL預(yù)處理10min后再與胰島素共作用20min，Akt和GSK3β的磷酸化水平及GLUT1上膜水平介于二者單獨(dú)作用之間；（8）沉默胰島素受體可阻斷50μg/mL LDL引起的LC3-II表達(dá)下降，及Akt、mTOR和GSK3β的磷酸化水平上調(diào)。（9）LDL單獨(dú)作用促進(jìn)細(xì)胞攝取2-NB