丹參素對氧化低密度脂蛋白損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響及作用機制探討.pdf

1、目的： 觀察丹參素對氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)損傷外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)功能的影響，并探討其可能的作用機制。 方法： 采用密度梯度離心法分離出人外周血單個核細(xì)胞(MNC)，以5×10個/c㎡密度接種細(xì)胞到預(yù)先已包被有纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1ml M199培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，VEGF10ng/ml，bFGF10ng/ml，青霉素100u/ml，鏈霉素100u/ml)。培養(yǎng)3天后，用

2、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)原條件培養(yǎng)。培養(yǎng)至第6天，收集貼壁細(xì)胞用不含胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h同步化后，隨機分成5組：正常對照組，氧化低密度脂蛋白組(含100 ug·mL-1Ox-LDL)、Ox-LDL+丹參素(2 ug·mL-1)、Ox-LDL+丹參素(10 ug·mL-1)、Ox-LDL+丹參素(50 ug·mL-1)。干預(yù)24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)細(xì)胞CD34、VE-Cadherin、VEG

3、FR-2、AC133的表達(dá)及Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化來驗證我們所培養(yǎng)的細(xì)胞就是EPCs。分別采用MTT比色法、黏附能力測定實驗觀察EPCs的增殖能力、黏附能力；取各組細(xì)胞上清液用SOD、MDA試劑盒行超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量檢測，采用ELISA試劑盒行白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量檢測。 結(jié)果： 1.EPCs的鑒定：分離獲得的單個核細(xì)胞培養(yǎng)3-7d后逐漸形成了梭形的內(nèi)皮

4、樣細(xì)胞。培養(yǎng)6 d后流式細(xì)胞儀分析示細(xì)胞表達(dá)CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及AC133，其中CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及AC133陽性細(xì)胞比例分別為65.09％±11.89％、44.69％±9.74％、30.46％±9.23％與19.68％±0.81％。CD34、VE-Cadherin雙陽性細(xì)胞比例為41.67％±10.18％，VEGFR-2、VE-Cadherin雙陽性細(xì)胞比例為28.19％±1

5、4.85％，CD34、AC133雙陽性細(xì)胞比例為18.67％±1.27％，VEGFR-2、AC133雙陽性細(xì)胞比例為15.10％±7.42％。 培養(yǎng)兩周后，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化陽性，胞質(zhì)呈棕褐色，空白對照及陰性對照不顯棕色。 2.同正常對照組相比，100μmol/L濃度的Ox-LDL干預(yù)24 h后，外周血EPCs的增殖能力(P<0.05)、黏附能力(P<0.05)顯著受損；細(xì)胞上清液SOD含量顯著下降(P<0.01)，

6、MDA含量顯著升高(P<0.01)，且顯著提高了內(nèi)皮祖細(xì)胞上清液的IL-6及TNF-α水平(P<0.001)。 3.丹參素不同濃度組干預(yù)24 h后，明顯改善了Ox-LDL干預(yù)后外周血EPCs的增殖能力(10μg·mL-1組達(dá)到最大效應(yīng))和黏附能力(呈劑量依賴性增加)；并且顯著提高了EPCs細(xì)胞上清液的SOD含量、降低了MDA的含量(P<0.01)，顯著降低了細(xì)胞上清液的IL-6和TNF-α濃度(P<0.05)。 結(jié)論：