RhoA激酶1在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、慢性腎臟疾病(CKD)在中國(guó)普通人群患病率高達(dá)11.8％-13.0％，與之相應(yīng)，中國(guó)每年新增腎臟替代治療患者人數(shù)不斷攀升，如何延緩CKD患者腎功能進(jìn)展成為亟需解決的難題。近年研究證明脂質(zhì)異常是公認(rèn)的促進(jìn)CKD持續(xù)進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨著高脂血癥發(fā)生率的增加，脂質(zhì)對(duì)腎臟的不良影響，特別是對(duì)合并CKD患者腎毒性日益受到重視。深入研究脂質(zhì)腎臟損傷的分子機(jī)制不僅可以加深對(duì)脂質(zhì)腎毒性的理論認(rèn)識(shí)，也有助于獲得防治和延緩CKD持續(xù)進(jìn)展的新思路。

2、>　　1982年，Moorhead提出“脂質(zhì)腎毒性”假說(shuō):腎小球病變所引起的高脂血癥和蛋白尿會(huì)導(dǎo)致腎臟疾病持續(xù)的進(jìn)展，而且脂質(zhì)的異常會(huì)同時(shí)造成動(dòng)脈粥樣硬化和腎小球硬化的形成，腎小球硬化和動(dòng)脈粥樣硬化是一系列相互存在聯(lián)系的臨床疾病中的一部分。我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)的小鼠腎小球足細(xì)胞首次發(fā)現(xiàn)，小鼠足細(xì)胞表達(dá)ROCK1，ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein)刺激能調(diào)節(jié)足細(xì)胞上ROCK1的活性并使裂孔膜

3、蛋白nephrin的表達(dá)下降。這個(gè)結(jié)果表明腎小球足細(xì)胞也許通過(guò)提高ROCK1的活性來(lái)參與脂質(zhì)腎臟損傷。但有關(guān)ox-LDL介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的具體調(diào)控機(jī)制，尚未得到深入的研究。
　　Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最為重要的效應(yīng)分子之一，它是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，有ROCK1和ROCK2兩個(gè)異構(gòu)體，可以被GTP結(jié)合蛋白R(shí)hoA激活（與GTP結(jié)合時(shí)被激活，與GDP結(jié)合時(shí)失活），激活的ROCK可以使其底物如肌球蛋白輕鏈、LIM激酶、埃

4、茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白、肌球蛋白磷酸化亞單位(MYPT)等磷酸化，在細(xì)胞收縮、中性粒細(xì)胞遷徙、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮極為重要的作用。有實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)抑制ROCK的表達(dá)可以增加自噬小體的體積，進(jìn)而促進(jìn)自噬的發(fā)生。另外有研究顯示在體外使用ROCK抑制劑Y-27632可以顯著增加細(xì)胞蛋白分解、減少異常蛋白質(zhì)的積聚，也可以激活細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白酶如泛素蛋白酶系統(tǒng)，增加自吞噬作用，促進(jìn)細(xì)胞的異常增多的物質(zhì)的消化和分解。
　　目的

5、:
　　本研究是通過(guò)在體外實(shí)驗(yàn)建立ox-LDL誘導(dǎo)的足細(xì)胞脂質(zhì)損傷模型，來(lái)觀察ox-LDL對(duì)小鼠足細(xì)胞ROCK1活性及nephrin表達(dá)的影響;并且通過(guò)使用ROCK1siRNA和wt ROCK1質(zhì)粒來(lái)雙向調(diào)節(jié)ROCK1來(lái)探討ROCK1對(duì)足細(xì)胞攝取脂質(zhì)、足細(xì)胞膽固醇含量的影響以及nephrin、LC3-Ⅱ、P62、p-ULK1(Ser757)表達(dá)的關(guān)系，初步來(lái)探討ROCK1參與脂質(zhì)腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　一

6、、小鼠的足細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定以及處理分組
　　（一）小鼠的足細(xì)胞培養(yǎng)方法
　　永生化條件下的足細(xì)胞(MPC)復(fù)蘇后，使用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和20-100U/mL重組的小鼠γ干擾素在5％CO2，在33℃條件下誘導(dǎo)增殖和傳代。后續(xù)轉(zhuǎn)入5％CO2，37℃培養(yǎng)箱分化等待成熟。
　?。ǘ┬∈笞慵?xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察以及鑒定
　　將33℃的培養(yǎng)箱和37℃的培養(yǎng)箱中的足細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下拍片，并觀察比較兩者之

7、間的形態(tài)學(xué)差異;采用足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin免疫染色來(lái)確定足細(xì)胞是否已經(jīng)分化成熟了，成熟的足細(xì)胞表達(dá)并且延著細(xì)胞骨架清晰分布。
　?。ㄈ┏墒熳慵?xì)胞的處理分組
　　(1)Ox-LDL刺激對(duì)足細(xì)胞ROCK1活性影響
　　(2)調(diào)控ROCK1的表達(dá)對(duì)p-MYPT/MYPT、nephrin等表達(dá)、足細(xì)胞攝取脂質(zhì)，細(xì)胞膽固醇濃度的影響
　　檢測(cè)內(nèi)容
　　使用酶法檢測(cè)足細(xì)胞膽固醇含量;Wester

8、n Blot檢測(cè)p-MYPT/MYPT、Nephrin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ等的蛋白表達(dá)水平;使用免疫熒光的方法來(lái)檢測(cè)足細(xì)胞中脂質(zhì)的變化情況。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間結(jié)果比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。
　　結(jié)果:
　　與正常對(duì)照組相比，ox-LDL刺激上調(diào)足細(xì)胞ROCK活性增加（p-M

9、YPT表達(dá)升高），同時(shí)伴有nephrin、LC3-Ⅱ表達(dá)下降(p＜0.05)，P62、p-ULK1表達(dá)上升（p均＜0.05），細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加(p＜0.05);抑制ROCK1表達(dá)能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的p-MYPT水平上調(diào)，同時(shí)上調(diào)nephrin、LC3-Ⅱ的表達(dá)(p＜0.05)，下調(diào)P62、p-ULK1的表達(dá)（p均＜0.05），降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量(p＜0.05);與之相反，增加ROCK1表達(dá)能進(jìn)一步增加ox-LDL誘導(dǎo)的p-MY