粘著斑激酶在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的體外足細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 近年來(lái)研究證明，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)在高膽固醇血癥相關(guān)性腎臟疾病發(fā)病中起重要作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ox-LDL可通過(guò)降低蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)活性誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。作為Akt上游調(diào)節(jié)因子，粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，在最近體內(nèi)外研究中，已被證實(shí)能介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。FAK

2、為一種分子量為125 kDa的非受體型酪氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞的分裂增殖、粘附和遷移等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，F(xiàn)AK還是一種接頭蛋白，其上載有蛋白分子結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合包括c-Src、Rho GTP酶、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated proteinkinase，p38 MAPK)等下游信號(hào)分子并參與各種生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。P38 MAPK作為為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated pr

3、otein kinase，MAPK)家族成員之一，具有產(chǎn)生炎癥介質(zhì)、介導(dǎo)細(xì)胞分裂與凋亡，以及參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架穩(wěn)定性等重要作用，并與高脂血癥引起的內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞等多種類(lèi)型細(xì)胞損傷密切相關(guān)。因此，本研究旨在探討ox-LDL對(duì)體外培養(yǎng)條件下足細(xì)胞的毒性機(jī)理，F(xiàn)AK/p38MAPK信號(hào)通路在ox-LDL誘導(dǎo)的體外足細(xì)胞損傷中的作用，以及其發(fā)生的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.LDL的氧化:LDL的氧化修飾采用硫酸銅氧化法;LDL

4、的修飾程度測(cè)定則采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法。
　　 2.TAE226的配制:將TAE226溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成30mmol/l濃度的儲(chǔ)存液，保存于-20℃。用于處理細(xì)胞時(shí)，以DMSO進(jìn)一步稀釋儲(chǔ)存液并加入培養(yǎng)基中，計(jì)算加入量調(diào)整培養(yǎng)基內(nèi)DMSO終濃度至0.1％(V/V)。
　　

5、3.細(xì)胞培養(yǎng)及分組:體外培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞系（由哈佛醫(yī)學(xué)院PeterMundel教授惠贈(zèng)）。在33C條件下，于用Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以含有10％血清及青鏈霉素的RPMI1640+10 U/ml重組小鼠γ-干擾素培養(yǎng)基培養(yǎng)以促進(jìn)足細(xì)胞增殖;在37C不加γ-干擾素的條件下培養(yǎng)至少14天促進(jìn)足細(xì)胞分化，并檢測(cè)足細(xì)胞分化成熟指標(biāo)WT-1。將分化成熟的足細(xì)胞分為5組進(jìn)行處理:正常組，高脂組(ox-LDL20μg/ml)，p38 siRNA組

6、，Cont-siRNA組，F(xiàn)AK抑制劑組(TAE2260.1μM)。
　　 4.足細(xì)胞損傷的測(cè)定:檢測(cè)足細(xì)胞正常指標(biāo)nephrin和WT-1表達(dá)，及損傷標(biāo)識(shí)desmin與vimentin的表達(dá)。
　　 5.FAK及p38 MAPK磷酸化的測(cè)定:檢測(cè)足細(xì)胞在ox-LDL誘導(dǎo)前后FAK及p38 MAPK的表達(dá)變化及其關(guān)系，并觀(guān)察不同處理組足細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.ox-LDL誘導(dǎo)體外足細(xì)胞損

7、傷。以ox-LDL刺激足細(xì)胞24小時(shí)后，與正常組相比較，足細(xì)胞WT-1及nephrin蛋白及mRNA水平均明顯下調(diào)（P＜0.05），而損傷性指標(biāo)desmin與vimentin的表達(dá)水平則顯著上升(P＜0.05)。
　　 2.FAK在ox-LDL誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過(guò)程中激活。在用ox-LDL培養(yǎng)的足細(xì)胞中，F(xiàn)AK被激活，即磷酸化p-FAK水平較正常組明顯增高（P＜0.05），總FAK表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。且這一變化與ox-

8、LDL誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷是一致的。
　　 3.FAK通過(guò)活化p38 MAPK參與ox-LDL誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。與正常組相比，ox-LDL刺激了足細(xì)胞中p38 MAPK活性升高，即p-p38MAPK水平升高（P＜0.05），這與FAK的激活及足細(xì)胞損傷是一致的:通過(guò)p38 siRNA進(jìn)行p38基因敲低，p38 MAPK與p-p38 MAPK含量均減少(P＜0.05)，同時(shí)觀(guān)察到足細(xì)胞WT-1及nephrin的蛋白及mRNA表達(dá)均較高

9、脂組升高（P＜0.05），損傷性標(biāo)志desmin與vimentin的表達(dá)則被下調(diào)(P＜0.05），而對(duì)FAK的激活無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　 4.抑制FAK的活化可改善ox-LDL誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。應(yīng)用FAK抑制劑TAE226，足細(xì)胞nephrin與WT-1蛋白及mRNA水平較高脂組上調(diào)(P＜0.05)，desmin與vimentin則下調(diào)(P＜0.05），同時(shí)伴有p-p38 MAPK水平顯著下降(P＜0.05)。