凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1在機械應(yīng)力誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用及其機制.pdf

1、以往研究發(fā)現(xiàn)，在沒有血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的參與下，機械應(yīng)力直接激活A(yù)ngⅡ1型受體(AT1R)引起心肌肥厚。AT1R阻滯劑（ARB）中的反向激動劑，而不是中和拮抗劑，可有效地阻斷這種非激動劑依賴的AT1R的活性以及隨之而來的心肌肥大。基于這一現(xiàn)象，目前很多研究都集中于探索新的ARB類藥物。然而，尋找一個新的靶點可能會產(chǎn)生事半功倍的效果。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)在機械應(yīng)力直接誘導(dǎo)的心肌肥厚的

2、病理過程中起著關(guān)鍵作用。
　　本試驗首先研究了LOX-1是否參與了機械應(yīng)力直接誘導(dǎo)的心肌肥厚，我們在血管緊張素原基因敲除（ATG-/-）小鼠上進行橫主動脈縮窄術(shù)(TAC)以達到壓力超負荷，或者在體外分離培養(yǎng)1-3日齡的ATG-/-小鼠的原代心肌細胞并進行機械牽張，來誘導(dǎo)心肌肥厚模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體試驗中用LOX-1中和抗體(NAB)或離體試驗中用LOX-1-shRNA，分別顯著減少壓力超負荷或機械牽張直接誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　

3、　其次，通過轉(zhuǎn)染LOX-1或AT1R的質(zhì)粒到無內(nèi)源性AngⅡ的COS7細胞中，并對表達了AT1R或LOX-1的細胞進行牽張，我們發(fā)現(xiàn)LOX-1可以介導(dǎo)機械牽張引起的JNK的磷酸化，因磷酸化JNK是心肌肥厚的重要標(biāo)志，表明LOX-1可能通過JNK信號直接介導(dǎo)機械應(yīng)力誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　最后，通過轉(zhuǎn)染LOX-1或AT1R的質(zhì)粒到無內(nèi)源性AngⅡ的COS7細胞中，并對表達了AT1R或LOX-1的細胞進行牽張，我們發(fā)現(xiàn)Src激酶，而不是

4、Gαq11或Jak2，在機械牽張誘導(dǎo)的LOX-1-JNK信號中被激活。這表明，Src激酶參與了機械應(yīng)力通過LOX-1-JNK信號通路誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　總的來說，本研究發(fā)現(xiàn)，LOX-1-Src-JNK信號通路可以不依賴于AngⅡ的參與而被機械應(yīng)力直接激活。本研究提示，對于壓力超負荷引起的心肌肥厚，LOX-1是一個很有前景的的治療靶點。
　　第一部分 LOX-1參與壓力超負荷直接誘導(dǎo)的心肌肥厚
　　目的:探討LOX-1

5、是否參與了壓力超負荷引起的心肌肥厚。
　　方法:選取10周齡的ATG-/-小鼠進行TAC以建立壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型。奧美沙坦（OLM，3mg·kg-1體重·day-1，口服，陽性對照）或LOX-1中和抗體(NAB，0.06 mg·kg-1體重·day-1，腹腔注射)從TAC術(shù)當(dāng)天開始給藥。2周后，對小鼠進行超聲心動圖檢測，心臟血流動力學(xué)檢測，心臟組織學(xué)和形態(tài)學(xué)檢測，并檢測肥厚相關(guān)基因和蛋白的表達。
　　結(jié)果:超聲心動

6、圖顯示，和Sham組相比，TAC組的左心室壁厚度增加，左室內(nèi)徑減小，心功能基本正常，小鼠的心重/體重比率(HW/BW)增加，心肌細胞橫截面積(CSA)也增加。此外，肥厚相關(guān)基因ANP，BNP和SAA的mRNA水平在TAC組明顯升高。以上所有的改變說明TAC組在術(shù)后2周出現(xiàn)了代償性的心肌肥厚。所有這些肥厚反應(yīng)在OLM或NAB治療下被明顯改善。檢測和心肌肥厚相關(guān)的分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路發(fā)現(xiàn)，TAC所誘導(dǎo)的磷酸化的ERKs、P38

7、以及JNKs的水平被OLM顯著降低。而在NAB處理組，只有ERKs和JNKs的磷酸化被明顯阻斷。
　　結(jié)論:這些證據(jù)表明， LOX-1參與了壓力負荷引起的心肌肥厚。
　　第二部分 LOX-1參與機械牽張直接誘導(dǎo)的心肌細胞肥大
　　目的:探討LOX-1是否參與了體外機械牽張裝置誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。
　　方法:從1-3日齡ATG-/-小鼠的心臟分離出原代心肌細胞并在預(yù)先鋪有鼠尾膠的硅膠皿中培養(yǎng)。貼壁的心肌細胞用con

8、trol-shRNA或LOX-1-shRNA處理4天后再機械牽張至原始長度的120％，時間持續(xù)8min/15min/30min或24h以分別進行細胞總蛋白或RNA的提取。
　　結(jié)果:和control-shRNA相比，LOX-1-shRNA預(yù)處理顯著降低機械牽張誘導(dǎo)心肌細胞表面積的增加、ERKs和JNKs的磷酸化和肥厚相關(guān)基因ANP和SAA的mRNA水平，但不影響機械牽張誘導(dǎo)的P38的磷酸化。
　　結(jié)論:這些證據(jù)表明，LOX-

9、1參與了機械牽張誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。
　　第三部分 LOX-1直接介導(dǎo)機械牽張誘導(dǎo)的JNKs的磷酸化
　　目的:探討LOX-1是否能夠直接介導(dǎo)機械應(yīng)力誘導(dǎo)的MAPK的磷酸化。
　　方法: COS7細胞因缺乏內(nèi)源性AngⅡ、AT1R以及LOX-1的表達被用在這部分研究。我們瞬時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、LOX-1或AT1R質(zhì)粒到培養(yǎng)于硅膠皿的COS7細胞中，24 h后，機械牽張細胞到原始長度的120％，持續(xù)8 min、15 min或3

10、0 min以分別檢測pERKs、pP38或pJNKs的水平。
　　結(jié)果:和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，AT1R轉(zhuǎn)染組的ERKs、P38和JNKs的磷酸化水平在機械牽張刺激后都被上調(diào)，這與以往的研究一致。JNKs的磷酸化，而不是ERKs和P38的磷酸化，在轉(zhuǎn)染LOX-1質(zhì)粒的COS7細胞中被機械牽張直接誘導(dǎo)。
　　結(jié)論:這些結(jié)果表明， LOX-1直接介導(dǎo)機械牽張誘導(dǎo)的JNKs的磷酸化。
　　第四部分 Src激酶參與機械牽張直接激活

11、的LOX-1-JNK通路
　　目的:研究G蛋白和非受體型酪氨酸激酶，如Janus激酶(JAK)家族和Src家族，是否參與機械牽張激活的LOX-1-JNK通路。
　　方法:瞬時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、LOX-1或AT1R質(zhì)粒到培養(yǎng)于硅膠皿的COS7細胞，24h后，機械牽張細胞到原始長度的120％，持續(xù)5min，5min或10min以分別檢測胞漿Gαq11，pJak2，和pSrc。PP2（Src酪氨酸激酶抑制劑，5μM）被用來探討機械牽張激

12、活的LOX-1-JNK通路是否需要Src激酶的參與。
　　結(jié)果:和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，機械牽張AT1R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組后Gαq11亞基發(fā)生了明顯的胞漿轉(zhuǎn)位，Jak2和Src的磷酸化都顯著上調(diào)，這與以前的研究結(jié)果一致。機械牽張LOX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組后Gαq11亞基沒有發(fā)生明顯的胞漿轉(zhuǎn)位，Jak2的磷酸化也沒有明顯上調(diào)。但是，Src的磷酸化在機械牽張LOX-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著增加。進一步實驗顯示，PP2抵消了機械牽張在轉(zhuǎn)染LOX-1質(zhì)粒的COS7

13、細胞中所誘導(dǎo)的JNKs的活化。
　　結(jié)論:這些結(jié)果表明，Src激酶，而不是Gαq11或Jak2，參與機械牽張激活的LOX-1-JNK通路。
　　結(jié)論:
　　1.在沒有AngⅡ的參與下，LOX-1可以直接介導(dǎo)機械應(yīng)力誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　2.機械應(yīng)力可以部分通過LOX-1-Src-JNK信號通路誘導(dǎo)心肌肥厚。
　　潛在的應(yīng)用價值的和創(chuàng)新點
　　1.我們探討了在沒有AngⅡ的參與下，機械應(yīng)力直接誘導(dǎo)的心肌