兩型TNF-α及其受體在小鼠心肌肥厚中作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　心力衰竭（Heart Failure，HF）是指由于各種病因所引起的心室收縮（舒張）功能下降、射血功能障礙，從而使心排血量不能滿足機(jī)體代謝的需要，器官、組織血液灌注不足引起的一些列臨床綜合征。在發(fā)達(dá)國(guó)家中，有近1-2％的成年人患有心力衰竭，在70歲以上的人群中，其發(fā)病率可以高達(dá)10％。而心力衰竭晚期的5年死亡率高達(dá)50％，其惡性程度不低于癌癥和艾滋病。心肌肥厚是心臟為適應(yīng)各種刺激而產(chǎn)生的心肌細(xì)胞體積增大，重量

2、增加，是心力衰竭過(guò)程中早期代償關(guān)鍵階段。目前研究認(rèn)為，引起心肌肥厚的主要機(jī)制有，機(jī)械性與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，慢性炎癥反應(yīng)激活等。了解心力衰竭的機(jī)制，特別是心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)變的過(guò)程，對(duì)于人們認(rèn)識(shí)心力衰竭以及在臨床中提供新的治療策略有著重要的意義。
　　心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過(guò)程是一個(gè)伴隨慢性炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。炎癥細(xì)胞因子常在心力衰竭病人體內(nèi)高表達(dá)，其通過(guò)影響心肌收縮力，引起心肌肥大，誘導(dǎo)心肌纖維化和凋亡，促進(jìn)心臟重構(gòu)等作用

3、促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。其中，瘤壞死因子（Tumor necrosis factoralpha，TNF-α）就是眾多炎癥因子的關(guān)鍵因子之一。自從1990年Levine等人發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α在心力衰竭患者體內(nèi)表達(dá)量明顯升高之后，研究人員圍繞TNF-α對(duì)心力衰竭的影響進(jìn)行了大量深入的研究，證實(shí)TNF-α及其受體在心肌肥厚和心力衰竭過(guò)程中扮演了重要的角色。其中目前公認(rèn)的TNF-α對(duì)心肌主要影響包括：干擾細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，激活一氧化氮合酶(

4、NOS)，升高局部NO水平，抑制心肌收縮力；激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的表達(dá)參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑；TNF-α與TNF-αR1或Fas結(jié)合后,激活細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等。鑒于TNF-α對(duì)心肌眾多負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抗腫瘤壞死因子治療方案也用于實(shí)驗(yàn)和臨床研究。然而，通過(guò)10年的研究，雖然抗腫瘤壞死因子治療在發(fā)生心力衰竭的大鼠和小鼠中被證明是有效的，但是在上世紀(jì)末、本世紀(jì)初進(jìn)行的TNF-α

5、拮抗劑治療心力衰竭病人的隨機(jī)、雙盲大規(guī)模臨床試驗(yàn)中卻沒(méi)有出現(xiàn)明顯的效果，甚至提高了心力衰竭患者的住院率和死亡率。所以對(duì)TNF-α進(jìn)行更深入、更細(xì)致的研究對(duì)于了解炎癥因子在心力衰竭中的作用機(jī)制以及解決抗炎治療在臨床中的問(wèn)題具有重要意義。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 不同TNF-α受體對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用及其機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接懺诓煌琓NF-α受體在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的

6、作用及其機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用胸主動(dòng)脈縮窄手術(shù)方法誘導(dǎo)壓力負(fù)荷性小鼠心力衰竭模型。以野生型小鼠為對(duì)照，在手術(shù)后2周觀察該心力衰竭模型在不同TNF-α受體敲除小鼠（TNFR1敲除小鼠，TNFR2敲除小鼠，TNFR1/2雙敲除小鼠）所出現(xiàn)的心肌肥厚進(jìn)展情況。檢測(cè)各個(gè)組中小鼠心臟形態(tài)、功能、血流動(dòng)力學(xué)改變，炎癥因子變化情況，并對(duì)心肌肥厚相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)，以明確與不同TNF-α受體相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路。

7、>　　2.使用AngII誘導(dǎo)H9c2（2-1）心肌細(xì)胞肥大，分別轉(zhuǎn)染相關(guān)TNF-α受體siRNA檢測(cè)其對(duì)心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，證實(shí)體內(nèi)試驗(yàn)并予以阻斷關(guān)鍵通路以檢測(cè)其能否達(dá)到改善心肌肥大的效果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.不同TNF-α受體在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的效應(yīng)，也就是TNFR1可以加重心肌肥厚程度、加重心臟收縮舒張功能障礙，TNFR2可以減輕心肌肥厚程度、改善心臟收縮舒張功能。<

8、br>　　2.在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性心肌肥厚中兩種TNF-α受體表達(dá)量均增加，但是TNFR1升高程度要高于TNFR2升高程度。
　　3.兩種TNF-α受體在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)，通過(guò)TNFR1促進(jìn)促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）減少抗炎因子（IL-10）表達(dá)，反之，TNFR2可以降低促炎因子表達(dá)，增強(qiáng)抗炎因子表達(dá)。
　　4.不同TNF-α受體介導(dǎo)不同心肌肥大相關(guān)信號(hào)通

9、路。
　　5.用siRNA沉默TNFR1表達(dá)可以減輕血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，用siRNA沉默TNFR2可以加重血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
　　6.TNFR1可以通過(guò)NFκB活化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而TNFR2可以通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。
　　第二部分 兩型TNF-α與不同TNF-α受體對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用及其機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接懣缒Ｐ秃头置谛蚑NF-α與不同TNF-

10、α受體在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用及其機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.在胸主動(dòng)脈縮窄手術(shù)方法誘導(dǎo)壓力負(fù)荷性不同TNF-α受體敲除小鼠心力衰竭模型中使用Alzet微量注射泵，給予TNF-α轉(zhuǎn)化酶（TNF-α-converting enzyme，TACE）抑制劑TAPI-1，以減少tmTNF-α向sTNF-α轉(zhuǎn)變。觀察tmTNF-α高表達(dá)時(shí)在不同TNF-α受體敲除小鼠中對(duì)心肌肥厚的作用和影響，了解tmTNF-α與兩種受體相

11、互關(guān)系，并找出相關(guān)信號(hào)通路。
　　2.在體外使用sTNF-α干預(yù)轉(zhuǎn)染相關(guān)TNF-α受體siRNA的H9c2（2-1）心肌細(xì)胞模擬高水平sTNF-α與不同受體相互關(guān)系及其對(duì)心肌細(xì)胞的作用和影響；使用高表達(dá)tmTNF-α的NIH3T3細(xì)胞與轉(zhuǎn)染相關(guān)TNF-α受體siRNA的H9c2（2-1）心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬高水平tmTNF-α與不同受體相互關(guān)系及其對(duì)心肌細(xì)胞的作用和影響。檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)通路，證實(shí)不同類(lèi)型TNF-α和不同TN

12、F-α受體相互關(guān)系，以及其對(duì)心肌細(xì)胞的作用和影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，tmTNF-α和sTNF-α表達(dá)和分泌量均有增加。
　　2.使用微量注射泵給予TACE抑制劑TAPI-1抑制tmTNF向sTNF轉(zhuǎn)變可以緩解胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚程度。這種效應(yīng)在野生型、TNFR1和TNFR2敲除小鼠中均可以檢測(cè)到，但是在TNFR2敲除小鼠中效應(yīng)更明顯。
　　3.通過(guò)體外試驗(yàn)，證明

13、了sTNF主要通過(guò)TNFR1介導(dǎo)心肌細(xì)胞胞毒效應(yīng)和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而tmTNF可以通過(guò)TNFR2減少心肌細(xì)胞凋亡和保護(hù)心肌的作用。
　　第三部分 初步探討骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞（myeloid-drived suppressor cells，MDSC）對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慚DSC在心力衰竭患者及心肌肥厚小鼠中的作用及機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心力衰竭患者外周

14、血中MDSC比例，證實(shí)MDSC與心力衰竭之間的關(guān)系。在不同TNFR敲除小鼠建立胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)心肌肥厚，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血、脾臟和心肌組織中MDSC變化情況。
　　2.在體外將不同類(lèi)型MDSC進(jìn)行分離和純化，將其與心肌細(xì)胞直接或間接共同培養(yǎng)，并檢測(cè)其對(duì)血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大影響和機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.心力衰竭患者外周血中MDSC數(shù)量隨著心力衰竭程度加重而升高。
　　2.胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)心肌

15、肥厚小鼠外周血、脾臟和心肌組織中MDSC比例均有增加，但TNFR1敲除小鼠MDSC增加比例最多。
　　3.通過(guò)體外MDSC與心肌細(xì)胞直接或間接共培養(yǎng)證明，MDSC與心肌細(xì)胞直接接觸時(shí)可以通過(guò)增加IL-10表達(dá)減輕血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，且表達(dá)TNFR2的MDSC IL-10表達(dá)量更高，抗心肌肥厚功能更強(qiáng)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組均數(shù)比較選

16、擇t檢驗(yàn)，對(duì)3組以上均數(shù)進(jìn)行組間比較，用單因素方差分析（ANOVA），p<0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性心肌肥厚中tmTNF、sTNF及其TNF-α受體表達(dá)量均增加，但是TNFR1升高程度要高于TNFR2升高程度。
　　2.不同TNF-α受體在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的效應(yīng)：TNFR1可以加重心肌肥厚程度、加重心臟收縮舒張功能障礙，TNFR2可

17、以減輕心肌肥厚程度、改善心臟收縮舒張功能。
　　3.兩種TNF-α受體在胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)，通過(guò)TNFR1促進(jìn)促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）減少抗炎因子（IL-10）表達(dá)，反之，TNFR2可以降低促炎因子表達(dá)，增強(qiáng)抗炎因子表達(dá)。
　　4.不同TNF-α受體介導(dǎo)不同心肌肥大相關(guān)信號(hào)通路。
　　5.siRNA沉默TNFR1表達(dá)可以減輕血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，用si

18、RNA沉默TNFR2可以加重血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
　　6.TNFR1可以通過(guò)NFκB活化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而TNFR2可以通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。
　　7.抑制tmTNF向sTNF轉(zhuǎn)變可以緩解胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚程度。尤其是在TNFR2敲除小鼠中效果更明顯。
　　8.sTNF主要通過(guò)TNFR1介導(dǎo)心肌細(xì)胞胞毒效應(yīng)和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而tmTNF可以通過(guò)TNFR2減少心肌細(xì)胞凋亡和保