MicroRNA-1--133在小鼠iPS細(xì)胞心肌分化中的作用及其機制研究.pdf

1、心血管疾病，尤其是心肌缺血引起的大量功能性心肌細(xì)胞損傷、死亡以及所導(dǎo)致的心臟疾病，如心衰等，已成為首要威脅人類健康的殺手。對于各種類型的終末期心血管疾病，目前傳統(tǒng)的治療手段僅能延緩病情發(fā)展而無法徹底治愈。利用再生醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合現(xiàn)代的生物醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)手段，已經(jīng)能夠在實驗室制作出人工組織器官，并且部分研究成果已經(jīng)用于臨床應(yīng)用。令人極為振奮的是，干細(xì)胞能夠分化再生成心肌細(xì)胞，再結(jié)合上組織工程技術(shù)，實現(xiàn)體外構(gòu)建心肌組織將不再是一個夢想。這將

2、為心血管疾病的治療帶來新的希望，因此現(xiàn)在研究的熱點集中在這方面。干細(xì)胞眾所周知的寶貴特性是：自我更新和多向分化?；诟杉?xì)胞分化而來的心肌細(xì)胞，無論成熟或者幼稚，均能夠有益于受損的心臟，恢復(fù)心臟功能，已成為目前以及未來治療心血管疾病的新策略。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）20世紀(jì)初首次報道，科學(xué)家費勁周折篩選出一批轉(zhuǎn)錄因子，組合排列后導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，最終劃時代性地制出了類似

3、于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）樣的多能干細(xì)胞。由于iPSC能夠從自體細(xì)胞逆分化獲得，因此避免了倫理學(xué)爭議及免疫排斥反應(yīng)等棘手問題，成為當(dāng)前的熱寵。然而，iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化目前還存在著靶細(xì)胞定向分化效率低、分化機制不清、靶細(xì)胞功能不夠成熟等問題，阻礙了其在心肌組織工程再生中的應(yīng)用。
　　MicroRNA（miRNA），研究火熱多年，是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA，不負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)

4、，卻能調(diào)節(jié)mRNA的翻譯。它們的序列高度保守，生物功能廣泛多樣。它通過降解mRNA抑制蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)，從而對細(xì)胞生長、分化、遷移、凋亡以及組織發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。大量研究發(fā)現(xiàn)，約有40余種microRNA參與調(diào)控心肌生理和病理活動，其中microRNA-1（miRNA-1）和microRNA-133（miRNA-133）已證實參與了胚胎期心肌生成及發(fā)育過程，且已證實miRNA-1與miRNA-133在肌組織中高度表達(dá)豐富。為此我們推測：miR

5、NA-1和miRNA-133可能參與調(diào)控iPSC定向分化為心肌細(xì)胞的過程，人為調(diào)控這一機制有助于促使iPSC更有效地向心肌細(xì)胞定向分化。
　　實驗?zāi)康模?br>　　研究miRNA-1與miRNA-133對miPSC向心肌細(xì)胞自發(fā)分化的影響；探討其參與miPSC心肌分化的相關(guān)作用機制。
　　實驗方法：
　　1)采用RT-PCR檢測miPSC未分化階段、新生乳鼠心肌細(xì)胞、miPSC自發(fā)分化過程中0 d、3 d、5 d、10

6、 d各時間點細(xì)胞內(nèi)miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)。
　　2)利用瞬時轉(zhuǎn)染方法對miPSC分別轉(zhuǎn)染miRNA-1、miRNA-133載體和二者共轉(zhuǎn)染（miRNA-1+133），并RT-PCR檢測miRNA-1及miRNA-133的轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況，驗證轉(zhuǎn)染有效性。
　　3)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞自發(fā)分化至第15天，檢測統(tǒng)計第15天跳動的心肌合胞體數(shù)量，并通過RT-PCR及qRT-PCR檢測心肌特異性的轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5的mRN

7、A，特別是心肌細(xì)胞特異性cTnT、α-MHC的mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計比較。
　　4)利用免疫化學(xué)染色方法，選用特意性的抗體來標(biāo)記心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白cTnT，用直觀的熒光圖像來驗證miPSC源性心肌細(xì)胞的分化。
　　5)分別添加ERK1/2/MAPK、JNK、FAK、AMPK通路經(jīng)典抑制劑，qRT-PCR檢測分別阻斷上通路后心肌標(biāo)志物表達(dá)情況，根據(jù)各個抑制劑的效果，篩選高度可疑的信號通路。
　　6)Western

8、blot檢測ERK通路蛋白磷酸化水平，比較添加抑制劑前后目標(biāo)蛋白表達(dá)變化和活性狀態(tài)變化，驗證其與cTnT的關(guān)系。
　　實驗結(jié)果：
　　1) miPSC在明膠單層培養(yǎng)中干性標(biāo)志物Oct4和Nanog持續(xù)強表達(dá)，而未檢測到miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)；miRNA-1和miRNA-133在小鼠心肌細(xì)胞中高表達(dá)；自發(fā)分化10天，能夠在纖維鏡下看到跳動的細(xì)胞團(tuán)；在分化的動態(tài)時間過程，從第5天開始，檢測到NKX2.5和cTn

9、T的表達(dá)，逐漸增多；miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)增長與時間正相關(guān)。證實第一：miPSC單層培養(yǎng)能夠自發(fā)分化成心肌細(xì)胞；第二：miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)隨著朝心肌細(xì)胞分化不斷進(jìn)行而不斷升高。這種密切的關(guān)系，強烈提示miRNA-1/133與iPSC的心肌細(xì)胞定向分化密切相關(guān)。
　　2)miPSC瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-1和miRNA-133，第三天檢測RNA表達(dá)結(jié)果，二者表達(dá)均顯著升高，顯示轉(zhuǎn)染成功，目的分子在細(xì)

10、胞內(nèi)表達(dá)顯著。
　　3)miRNA-1與miRNA-133單獨過表達(dá)對miPSC向心肌細(xì)胞分化沒有顯著作用，但二者共轉(zhuǎn)染能夠顯著增強心肌分化，提示miRNA-1與miRNA-133間存在協(xié)同作用共同促進(jìn)心肌分化定向分化。RT-PCR檢測心肌特異性標(biāo)記物Nkx2.5、α-MHC、cTnT、MLC2a/2v表達(dá)水平證實miPSC向心肌分化顯著升高。
　　4)分化結(jié)束，心肌特異性蛋白cTnT染色標(biāo)記的熒光成像照片顯示：miPSC可

11、在體外自發(fā)性分化出跳動的心肌細(xì)胞，單獨轉(zhuǎn)染過表達(dá)miRNA-1與miRNA-133對心肌分化無明顯影響，但是共轉(zhuǎn)染能夠顯著增強心肌細(xì)胞的分化形成，而且分化形成的心肌細(xì)胞肌節(jié)呈竹節(jié)樣形態(tài)，結(jié)構(gòu)比較成熟。
　　5)ERK1/2/MAPK、JNK、FAK、AMPK通路抑制篩選發(fā)現(xiàn)，只有使用ERK1/2/MAPK通路抑制劑時，才會明顯阻斷掉miRNA-1/-133的聯(lián)合促心肌分化作用。提示miRNA-1/-133的聯(lián)合促心肌分化作用可能是

12、通過調(diào)節(jié)ERK1/2/MAPK通路來實現(xiàn)的。
　　6)Western blot半定量檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA-1和miRNA-133聯(lián)合過表達(dá)能夠升高miPSC分化過程中ERK1/2和磷酸化ERK（p-ERK1/2）的表達(dá)水平，添加p-ERK1/2抑制劑（PD98059）顯著削減p-ERK1/2水平，并高度抑制cTnT的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　miRNA-1與miRNA-133協(xié)同參與iPSC向心肌細(xì)胞的定向分化過程，早期