GILZ在脂肪細(xì)胞分化中的作用及其調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、脂肪細(xì)胞是哺乳動物的一類重要功能細(xì)胞,在維持脂類代謝及能量代謝平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程,這一過程受到許多轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子以及激素的調(diào)節(jié)。脂肪細(xì)胞分化與調(diào)控失?？蓪?dǎo)致人類多種疾病如肥胖癥、2型糖尿病、脂肪肝、高脂血癥及乳腺癌等。前脂肪細(xì)胞的增殖和分化過程可能是研究肥胖癥發(fā)生機制的核心,同時對前脂肪細(xì)胞的增殖和分化過程的研究還可以有助于尋找減肥藥物作用的靶點。因此,在細(xì)胞和分子水平上對脂肪細(xì)胞分化

2、調(diào)控機制研究,對探討上述重大生命和疾病過程、探索預(yù)防與治療的新途徑具有重要理論意義和應(yīng)用價值。
　　 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈蛋白(glucocorticoidinduced leucine zipper,GILZ)被報道是一種糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白,具有炎癥抑制、保護T細(xì)胞凋亡等多項作用。糖皮質(zhì)激素具有誘導(dǎo)細(xì)胞生長、分化和凋亡等多種功能,被認(rèn)為是較好的抗炎及免疫抑制劑,已廣泛用于多種疾病的治療

3、,如關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、哮喘、器官抑制排斥反應(yīng)等。但重要的是長期的使用糖皮質(zhì)激素,會加速骨的丟失導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,取而代之的是骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加。報道初步顯示GILZ可能通過抑制脂肪發(fā)生而拮抗糖皮質(zhì)激素的作用,在GC作用當(dāng)中起了負(fù)反饋作用。
　　 第一部分 GILZ真核表達載體的構(gòu)建、表達定位,穩(wěn)定高表達GILZ的3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的克隆
　　 目的:
　　 克隆、構(gòu)建HA標(biāo)簽的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈蛋白GI

4、LZ真核表達載體,觀察其在細(xì)胞中表達與定位,建立3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型及GILz穩(wěn)定高表達株,為研究GILZ在脂肪細(xì)胞分化中的作用提供基因和細(xì)胞工具。
　　 方法:
　　 1.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法從C3H10T1/2多能干細(xì)胞中擴增GILZ cDNA編碼區(qū),并將其重組于帶有HA標(biāo)簽的真核表達載體PcDNA3中。BamH I/Xho I雙酶切、DNA測序鑒定HA-GTLZ/PcDNA3重組表達載體。<

5、br>　　 2.采用lipofectamine 2000脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體至C3H10T1/2多能干細(xì)胞；采用CaC12方法瞬時轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體至293T細(xì)胞。
　　 3.采用HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體通過lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞,采用G418篩選HA-GILZ穩(wěn)定表達的3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞系。
　　

6、 4.轉(zhuǎn)染48h后,采用免疫熒光檢測GILZ在C3FH10T1/2多能干細(xì)胞和3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)的表達、分布定位；采用免疫印跡法檢測GILZ在2931 細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3的3T3-L1前脂肪細(xì)胞系內(nèi)的穩(wěn)定表達及分子量大小。
　　 5.用含0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(MIX)、10μg/m1胰島素和0.25μmol/L地塞米松的脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑(MID)誘導(dǎo)3T3-L1前肪細(xì)胞

7、分化,用油紅0 染色法觀測脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)特異性著色及測定甘油三酯相對含量。
　　 小結(jié):
　　 1.成功構(gòu)建和表達HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體,為GILZ的功能研究提供了穩(wěn)定的基因工具。
　　 2.實驗表明GILZ主要定位表達于C3H10T1/2和3T3-L1細(xì)胞質(zhì)中。
　　 3.成功地誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化,并成功建立穩(wěn)定、高表達的3T3-L1細(xì)胞克隆,為GILZ的功能研究提供了

8、穩(wěn)定的細(xì)胞工具。
　　 第二部分:GILZ對前脂肪細(xì)胞增殖、脂肪細(xì)胞分化及相關(guān)基因表達的影響
　　 目的:
　　 觀測GILZ對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化的作用,研究GILZ對脂肪細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志基因PPAR γ 2,C/EBPα,LPL和FAS mRNA表達的影響,探討GILZ調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的分子機制。
　　 方法:
　　 1.采用MTT法,從第1天到第11天,每隔2天檢測

9、GILZ穩(wěn)定表達3T3-L1細(xì)胞細(xì)胞的增殖情況。
　　 2.油紅O染色觀察GILZ過表達對脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯相對含量的影響。共分四組:1,轉(zhuǎn)染對照PcDNA3,沒有MID誘導(dǎo)；2,轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3,沒有MID誘導(dǎo)；3,轉(zhuǎn)染對照PcDNA3,MID誘導(dǎo)9天；4,轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3,MID誘導(dǎo)9天。
　　 3.常規(guī)構(gòu)建GILZ-shRNA/pLentiLox 3.7(簡稱GILZ-shRNA

10、)慢病毒重組載體、測序、lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、293T細(xì)胞包裝、感染GILZ穩(wěn)定表達的3T3-L1細(xì)胞、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測脂肪細(xì)胞GILZmRNA表達。
　　 4.實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測脂肪細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志基因PPAR γ 2、C/EBPα、LPL和FAS的mRNA表達。對于GILZ過表達共分二組:轉(zhuǎn)染PcDNA3對照空載體；轉(zhuǎn)染HA-G

11、ILz/PcDNA3重組載體；對于GILZ沉默共分二組:感染pLentiLox 3.7空載體對照；感染(GILZ-shRNA/pLentiLox 3.7重組載體。
　　 小結(jié):
　　 1.GILZ對前脂肪細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響。
　　 2.制備的shRNA慢病毒能成功沉默GILZ的mRNA表達。
　　 3.GILZ過表達或沉默叮顯著性抑制或增加PPAR γ 2,C/EBPα,LPL和FAS的mRNA表達

12、,表明GILZ可能通過F調(diào)脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子PPAR γ 2,C/EBPα的表達而抑制脂肪細(xì)胞特異性基因LPL和FAS的表達,進而抑制脂肪細(xì)胞的分化。
　　 第三部分:C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPAR γ 2啟動子轉(zhuǎn)錄活性中的作用
　　 目的:
　　 通過分析C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPAR γ 2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用,探討GILZ抑制脂肪細(xì)胞的調(diào)控機制。
　　

13、 方法:
　　 使用熒光素酶(Luciferase)雙報告基因系統(tǒng)檢測GILZ對PPAR γ 2啟動子區(qū)各順式作用元件轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 1.分別用0.1 μg-615/-265-Luc報告基因(涵蓋了PPAR γ 2啟動子區(qū)的含C/EBP順式作用元件)、-265/-1-Luc報告基因(涵蓋了PPAR γ 2啟動子區(qū)的含AP-1順式作用元件),同時轉(zhuǎn)染0.01μg pRL-SV40(起校正作用報告基因)、PcDNA

14、3(對照)與HA-GILZ/PcDNA3不同比例的質(zhì)粒于3T3-L1細(xì)胞,48h后檢測熒光素酶活性。根據(jù)PcDNA3與HA-GILZ/PcDNA3不同比例,共分四組:1,對照組,0.45 μg PcDNA3；2,0.30μg PcDNA3+0.15μg HA-GILZ/PcDNA3；3,0.15μgPcDNA3+0.30μg HA-GILZ/PcDNA3；4,0.45μg HA-GILZ/PcDNA3。
　　 2.分別用0.1μ

15、g-615/-1-Luc(含C/EBP和AP-1的PPAR γ 2啟動子區(qū)報告基因)、-615/-265-Luc、-265/-1-Luc,同時轉(zhuǎn)染0.01 μg pRL-SV40、PcDNA3或0.45μg HA-GILZ/PcDNA3質(zhì)粒于3T3-L1細(xì)胞,48h后檢測熒光素酶活性。根據(jù)報告基因的不同,共分四組:1,對照組,0.45μg PcDNA3+0.1μg-615/-1-Luc；2,0.45μg HA-GILZ/PcDNA3+0

16、.1μg-615/-265-Luc； 3,0.45μgHA-GILZ/PcDNA3+0.1 μg-265/-1-Luc；4,0.45μg HA-GILZ/Pc DNA3+0.1 μg-615/-1-Luc
　　 小結(jié):
　　 1.C/EBP和AP-1順式作用元件二者在GILZ對PPAR γ 2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用中都起了明顯的作用。
　　 2.C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPAR γ 2啟動

17、子轉(zhuǎn)錄作用中,C/EB作用要強于AP-1。
　　 3.C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPAR γ 2啟動子轉(zhuǎn)錄作用中,具有協(xié)同作用。
　　 結(jié)論:
　　 三部分實驗總結(jié)如下:
　　 1.成功構(gòu)建HA-GILZ/PeDNA3重組表達載體和建立GTLZ穩(wěn)定表達的3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型。
　　 2.免疫熒光顯示GILZ在C3H10T1/2和3T3-L1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達