gp78在肝細(xì)胞脂肪變性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　脂肪肝(fatty liver disease，F(xiàn)LD)，是最常見的引起慢性肝病的疾病，威脅著全世界尤其是發(fā)展中國家人類的健康。肝病指南明確指出，F(xiàn)LD與代謝相關(guān)危險(xiǎn)因素有密切的關(guān)系，尤其是肥胖、2型糖尿病和血脂代謝障礙。FLD分為酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)和非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以及

2、兩者同時存在。NAFLD包括單純性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）。NASH的發(fā)病機(jī)制與代謝紊亂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）穩(wěn)態(tài)相關(guān)。gp78也稱為自分泌因子受體（autocrine motility factor receptor，AMFR），是一種E3泛素連接酶，在保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷中起到重要的作用。已有研究證實(shí)，gp78在調(diào)

3、節(jié)小鼠脂肪和能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。然而目前關(guān)于gp78在肝細(xì)胞脂肪代謝中的具體作用還不清楚。本研究中我們將進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)gp78在肝細(xì)胞脂肪代謝中的作用以及探討相關(guān)的機(jī)制。研究目的：
　　1.在細(xì)胞水平建立肝細(xì)胞脂肪變性模型，明確gp78在肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性過程中表達(dá)水平的變化；
　　2.在發(fā)生脂肪變性的肝細(xì)胞中過表達(dá)或沉默gp78后，觀察肝細(xì)胞脂肪變性的程度；
　　3.明確過表達(dá)或沉默 gp78對脂肪分化/代謝相關(guān)

4、蛋白表達(dá)的影響；
　　4.研究gp78在肝細(xì)胞脂肪變性中的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.用一定濃度的油酸刺激小鼠肝細(xì)胞（AML12），應(yīng)用油紅O染色的方法對細(xì)胞內(nèi)的脂滴進(jìn)行染色，應(yīng)用相差顯微鏡對細(xì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行觀察拍照，應(yīng)用甘油三酯測定方法對細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量進(jìn)行檢測，從而確定肝細(xì)胞脂肪變性的程度；
　　2.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PCMV5-HA-gp78，設(shè)計(jì)并驗(yàn)證gp78的有效 siRNA干擾序列。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

5、染的方法向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騌NA；
　　3.提取細(xì)胞蛋白和RNA，分別應(yīng)用western blot和Real time PCR對目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測；
　　4.應(yīng)用免疫熒光法明確gp78與Cidec在亞細(xì)胞的定位，以及應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)確定gp78在肝細(xì)胞脂肪變性過程中與Cidec是否存在直接的直接相互作用關(guān)系。
　　研究結(jié)果：
　　1.應(yīng)用一定濃度的油酸刺激小鼠肝細(xì)胞（AML12），在刺激后的0h，12h

6、，24h收集細(xì)胞，應(yīng)用油紅O染色以及相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著刺激時間延長，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)目明顯增多，脂滴明顯增大，說明肝細(xì)胞脂肪變性模型建立成功。并同時在對應(yīng)的時間點(diǎn)，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)和RNA，檢測細(xì)胞內(nèi)gp78的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著刺激時間延長，gp78的表達(dá)含量也逐漸升高。
　　2.應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過表達(dá)gp78和瞬轉(zhuǎn)gp78-siRNA沉默gp78，發(fā)現(xiàn)與未處理對照組相比，過表達(dá)gp78組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)目增多，體積增大；而沉默gp7

7、8組脂滴數(shù)目減少，體積減小。
　　3.在研究過程中，Wenstern Blot結(jié)果顯示過表達(dá)或沉默gp78后，脂滴表面蛋白Cidec和PPARγ表達(dá)水平的變化與gp78一致。而共同過表達(dá)gp78和Cidec后，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)目顯著增多，體積顯著增大。
　　4.免疫熒光結(jié)果顯示，gp78和Cidec在脂滴表面存在共同的亞細(xì)胞定位；免疫共沉淀結(jié)果顯示gp78和Cidec存在直接相互作用關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　本研究證實(shí)