自噬在胰高血糖素樣肽-1干預(yù)肝細(xì)胞單純性脂肪變性中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)是指在無過多酒精攝入同時排除病毒性、藥物性、全胃腸外營養(yǎng)、先天性及自身免疫性等損肝因素的前提下出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，包括一系列病變，從單純性脂肪肝(simple hepatic steatosis)到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后者可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、

2、肝硬化，甚至是肝細(xì)胞癌。隨著西方生活方式的流行和生活水平的提高，NAFLD發(fā)病率逐年上升。因此NAFLD已經(jīng)成為危害健康的重大衛(wèi)生問題。
　　既往認(rèn)為單純性脂肪肝階段為良性病變，所以對其防治不夠重視。然而研究發(fā)現(xiàn)約20％的單純性脂肪肝患者可以發(fā)展成NASH;與正常肝臟相比，單純性脂肪肝階段的肝臟較易受到藥物、工業(yè)毒物、酒精、缺血以及病毒感染等傷害，導(dǎo)致其他類型肝病發(fā)生;單純性脂肪肝可以加重胰島素抵抗和代謝紊亂;單純性脂肪肝也是糖尿

3、病進(jìn)展、動脈粥樣硬化加重和血管功能失調(diào)的獨立危險因子。因此積極干預(yù)單純性脂肪肝對NAFLD的早期防治意義重大。
　　然而NAFLD的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，故治療尚停留在減少危險因素及飲食、運動的干預(yù)，缺乏特別有效的藥物治療。胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)由小腸L細(xì)胞分泌，具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用，同時還有增加飽腹感、減慢胃排空、減輕體重及促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖等作用。目前

4、的研究發(fā)現(xiàn)人類肝細(xì)胞上存在GLP-1的受體，并且GLP-1能夠降低肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。但GLP-1是否能夠在單純性肝細(xì)胞脂肪變性階段起作用及其作用機制如何，尚需進(jìn)一步研究。
　　自噬(Autophagy)是真核細(xì)胞中普遍存在的一種物質(zhì)降解途徑，通過自噬-溶酶體介導(dǎo)，清除自身多余的蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)利用，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。最近的研究表明自噬參與脂質(zhì)的降解。GLP-1類似物能夠減輕脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積

5、，與自噬相關(guān)的標(biāo)志物Beclin-1和LC3B-Ⅱ生成增加，電鏡觀察到自噬體數(shù)量增加。由此推測自噬很可能參與了GLP-1減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的過程，但自噬是否在單純性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起作用尚需進(jìn)一步的研究。
　　第一部分肝細(xì)胞單純性脂肪變性模型的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建肝細(xì)胞單純性脂肪變性模型，然后進(jìn)行鑒定以判斷能否模擬人體單純性脂肪肝的病理特點。
　　方法:常規(guī)10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞系L-02

6、細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)70-80％時進(jìn)行消化傳代。然后正常組換用新鮮的完全培養(yǎng)基，模型組換用含1mmol/L游離脂肪酸混合物（油酸∶棕櫚酸=2∶1）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，分別進(jìn)行油紅O染色、細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測定評價細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞內(nèi)丙二醛測定評價氧化應(yīng)激情況，Hoechst33342染色、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞檢測及Western blot檢測cleaved caspas

7、e-3蛋白的表達(dá)以比較兩組細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果:油紅O染色顯示模型組細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色脂滴形成，而正常組未見明顯脂滴形成。細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測定證實模型組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量明顯高于正常組(p＜0.01)。兩組在細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激方面均無明顯差異。Hoechst33342染色結(jié)果表明兩組細(xì)胞凋亡均不明顯。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示兩組細(xì)胞的早期凋亡比例無顯著性差異。Westernblot檢測顯示兩

8、組細(xì)胞cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平均很低。
　　小結(jié):使用含1mmol/L游離脂肪酸混合物（油酸∶棕櫚酸=2∶1）的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)L-02細(xì)胞24小時能夠構(gòu)建類似人單純性脂肪肝病理改變的肝細(xì)胞單純性脂肪變性模型。
　　第二部分自噬在GLP-1干預(yù)肝細(xì)胞單純性脂肪變性中的作用
　　目的:觀察利拉魯肽（GLP-1長效類似物）干預(yù)對肝細(xì)胞單純性脂肪變性細(xì)胞模型脂質(zhì)沉積的影響及自噬在這一過程中的作用。

9、>　　方法:取L-02細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基并加入適當(dāng)體積的注射用水，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，作為正常組。另外按照第一部分方法構(gòu)建肝細(xì)胞單純性脂肪變性模型，然后分為5組:模型組、利拉魯肽10nM組、利拉魯肽100nM組、利拉魯肽100nM+3-Methyladenine（3-MA，3-甲基腺嘌呤，自噬抑制劑）組、雷帕霉素(Rapamycin，自噬增強劑)組，并依次給予相應(yīng)的處理，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。取上述6組細(xì)胞，分別進(jìn)行油紅O染色、

10、細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測定評價細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積程度的變化，RT-PCR、Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Beclin-1、p62、LC3B的mRNA和蛋白水平的變化，電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體情況。
　　結(jié)果:1.油紅O染色顯示利拉魯肽干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量較模型組明顯減少，其中100nM組更為明顯。同時使用利拉魯肽100nM和自噬抑制劑3-MA進(jìn)行干預(yù)時，細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量較單獨使用利拉魯肽100nM增加，但仍較模型組少。自噬增強劑雷帕霉素干預(yù)

11、同樣能夠減少細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量。細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測定的結(jié)果與油紅O染色結(jié)果基本一致。
　　2.RT-PCR的結(jié)果表明各組Beclin-1 mRNA表達(dá)水平無明顯差異。P62mRNA表達(dá)水平在各組（除正常組外）間無明顯差異。模型組LC3BmRNA表達(dá)水平低于正常組，但沒有明顯差異。利拉魯肽10nM組、100nM組LC3B mRNA表達(dá)水平均高于模型組，其中100nM組有顯著性差異(p＜0.05)。而利拉魯肽100nM+3-MA組LC3B

12、 mRNA表達(dá)水平明顯低于利拉魯肽100nM組(p＜0.05)。雷帕霉素干預(yù)后LC3B mRNA表達(dá)水平明顯高于模型組(p＜0.05)。Western blot檢測各組Beclin-1、p62以及LC3BⅡ的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與RT-PCR變化大體一致。使用Bafilomycin阻斷自噬體和溶酶體的融合，通過比較阻斷前后LC3BⅡ蛋白表達(dá)量的變化來觀察各組自噬潮的大小，結(jié)果顯示:模型組低于正常組，利拉魯肽100nM組明顯高于模型組，

13、而利拉魯肽100nM+3-MA組低于利拉魯肽100nM組，仍高于模型組。雷帕霉素組明顯高于模型組。
　　3.電鏡觀察顯示正常組L-02細(xì)胞內(nèi)可見較多線粒體，少量自噬體。模型組細(xì)胞內(nèi)見大量脂質(zhì)空泡，未見自噬體。利拉魯肽100nM組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)空泡較少，見大量自噬體。而利拉魯肽100nM+3-MA組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量較少，脂質(zhì)空泡較多，有融合成片現(xiàn)象。雷帕霉素組細(xì)胞內(nèi)見較多自噬體和少量脂質(zhì)空泡。
　　小結(jié):利拉魯肽能夠減輕肝細(xì)胞單純

14、性脂肪變性細(xì)胞模型的脂質(zhì)沉積，并且有一定的劑量依賴性。利拉魯肽減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的過程中存在自噬增強的現(xiàn)象，而抑制自噬可使利拉魯肽減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用減弱。單獨增強自噬也能減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。由此推測自噬可能是利拉魯肽減輕肝細(xì)胞單純性脂肪變性模型脂質(zhì)沉積的機制之一。
　　全文結(jié)論
　　1.使用1mmol/L游離脂肪酸混合物（油酸∶棕櫚酸=2∶1）誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞24小時，能夠構(gòu)建類似人單純性脂肪肝病理改變的