IL-23在肝細胞肝癌發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分：IL-23表達質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構建
　　目的：小鼠IL-23融合基因片段的克隆及hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構建。
　　方法：取小鼠hepa1-6細胞提取總RNA,通過RT-PCR克隆p19基因的編碼區(qū)和p40基因編碼區(qū)的成熟區(qū)；采用重疊延伸PCR的方法，通過編碼一段柔性肽段(Gly4Ser)3的DNA序列連接p19片段和p40片段，構建小鼠IL-23單鏈融合基因，添加酶切位點，并將其克隆至 pRRL-Venus慢

2、病毒載體中。通過包裝慢病毒感染hepa1-6細胞，再通過流式分選的方法篩得可以穩(wěn)定表達IL-23的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。
　　結果：DNA測序結果表明：小鼠IL-23融合基因中p19、linker及p40的連接順序、方向及翻譯成氨基酸序列完全正確。
　　結論：成功克隆小鼠IL-23單鏈融合基因并構建其慢病毒質(zhì)粒。成功構建可以穩(wěn)定表達IL-23的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。為進一步研究IL-23在肝細胞肝癌發(fā)展中的作用及其機

3、制奠定了基礎。
　　第二部分：IL-23對肝細胞肝癌細胞系的生物學行為的影響
　　目的：體外檢測IL-23對肝細胞肝癌細胞的生物學行為的影響。
　　方法：通過一系列體外實驗檢測 IL-23對肝細胞肝癌細胞的生物學行為的影響。包括：采用MTT實驗、Ki-67染色實驗檢測IL-23對肝細胞肝癌細胞的生長、增殖的影響；通過Annexin V和7AAD的流式染色檢測IL-23對肝癌細胞的細胞凋亡的影響；通過細胞周期的流式染色檢

4、測IL-23對肝癌細胞的細胞周期的影響；通過劃痕實驗及transwell實驗檢測IL-23對肝癌細胞的遷移能力的影響。
　　結果：MTT實驗和Ki-67染色結果顯示IL-23促進肝癌細胞的增殖；細胞凋亡的染色結果表明IL-23不影響肝癌細胞的細胞凋亡；細胞周期的結果表明IL-23促進肝癌細胞維持在S期和G2期；劃痕實驗和transwell實驗提示IL-23可以促進肝癌細胞的遷移。
　　結論：體外實驗揭示IL-23可以促進肝癌

5、細胞的生長、增殖和遷移，并且可以促進肝癌細胞維持在S期和G2期，但是不影響肝癌細胞的細胞凋亡。
　　第三部分：IL-23在肝細胞肝癌發(fā)展中的作用及機制的研究
　　目的：利用小鼠肝癌動物模型探究IL-23在肝細胞肝癌發(fā)展中的作用及其可能的機制。
　　方法：(1)構建肝癌模型：(a.)取對數(shù)生長期的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞用 PBS制成單細胞懸液(5×105/ml)，每只小鼠注射的細胞量為1×106/2 ml PBS，利用高

6、壓水流動力學的注射方法在5-8s內(nèi)將細胞通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。3周后處死小鼠，取出小鼠肝臟，計數(shù)肝臟腫瘤結節(jié)數(shù)；(b.)提前一周給小鼠喝含抗生素(80000U/250ml)的酸性水。取對數(shù)生長期的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞用PBS制成單細胞懸液(4×107/ml)，每只小鼠注射的細胞量為1×106/25μl PBS，利用手術的方法，在超凈工作臺中，將小鼠腹部剖開一小口，擠出肝臟一葉，用胰島素注射器吸取細胞緩慢的注射入暴露的肝臟中，再將小

7、鼠傷口縫合。2周后處死小鼠，取出小鼠肝臟，測量并計算小鼠腫瘤體積；(c.)取14天大的C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射 DEN(25mg/kg)，于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)8-10個月，從第5個月開始，每兩個月采用高壓水流動力學的方法注射對照及IL-23微環(huán)質(zhì)粒，8個月后處死小鼠，計數(shù)肝臟腫瘤結節(jié)數(shù)并測量腫瘤體積。
　　(2)通過流式染色檢測荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞后1周的非荷瘤鼠脾臟和肝臟中淋巴細胞表面CD3、CD4、C

8、D8、CD62L、CD44、CD25、CD127、CD11b、Gr1等marker的陽性率；胞內(nèi)染色檢測荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞后1周的非荷瘤鼠脾臟和肝臟中 CD4+ T淋巴細胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A以及CD8+ T細胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A。利用IL-17A敲基因小鼠重復HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞構建肝癌模型的實驗確定IL-17A在IL-23介導的促進肝細胞肝癌發(fā)展中的作用

9、。采用CBA染色探究IL-23對外周血中細胞因子的影響。
　　結果：通過不同方法構建的肝癌模型表明IL-23在肝細胞肝癌發(fā)展中具有促進作用。流式染色結果表明在肝細胞肝癌發(fā)展后期 IL-23影響了脾臟和肝臟中MDSC、Treg等抑制性細胞的所占的比例及IFN-γ、TNF-α和IL-17A的分泌。在肝細胞肝癌發(fā)展早期流式染色結果表示 IL-23影響了肝臟中 CD4+效應 T細胞和CD8+效應T細胞的比例以及脾臟和肝臟中IL-17A的表