IL-23和Th17細(xì)胞在多發(fā)性硬化發(fā)病中作用的研究.pdf

1、多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的炎癥性脫髓鞘性疾病，多發(fā)生于年輕患者，具有反復(fù)發(fā)作、病情進(jìn)行性加重，預(yù)后差等特點(diǎn)。很多患者由于炎癥反復(fù)發(fā)作，病情難以控制而導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能喪失，給社會和家庭帶來嚴(yán)重的危害。 MS的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，在EAE中起核心作用的是IL—23誘導(dǎo)產(chǎn)生的以分泌IL-17、IL-17F、TNF、IL—6等促炎癥細(xì)胞因子為特征的Th17細(xì)胞。正是這群Th17細(xì)胞亞群具有高度的致病性，并對EAE的誘導(dǎo)

2、和維持起關(guān)鍵的作用。 IL—23是最近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥細(xì)胞因子，在促進(jìn)Th17細(xì)胞的生成和功能的發(fā)揮中起著關(guān)鍵性的作用。IL—23是IL-12家族新成員，是由其特有的p19亞基和與IL-12共有的p40亞基構(gòu)成的異源性二聚體。同樣，IL—23的受體也由一條是和IL-12R共同的IL-12Rβ1以及另一條特有的受體鏈IL—23R所組成。IL—23透過與其受體相結(jié)合，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和增殖，并促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌特征性炎癥因

3、子IL-17，從而構(gòu)成IL—23-IL23R—Th17-IL-17通路，在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)腱中起著重要作用。在炎癥性腸病、銀屬病以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的組織和體液中均檢測到IL—23和IL-17的高表達(dá)。在MS患者的腦組織內(nèi)也發(fā)現(xiàn)IL—23和IL-17表達(dá)上調(diào)。 本實(shí)驗(yàn)對IL—23-IL23R—Th17-IL-17通路在MS發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究。以期揭示IL—23和Th17細(xì)胞在MS發(fā)病中的地位和作

4、用。并進(jìn)一步探討了糖皮質(zhì)激素治療MS對Th17細(xì)胞和IL-17的影響。最后我們還對中國人群中IL—23及其受體基因單核苷酸多態(tài)性與MS的關(guān)系進(jìn)行了研究。 第一部分IL-23和Th17細(xì)胞在多發(fā)性硬化發(fā)病中作用的研究 目的： 研究IL—23/Th17細(xì)胞通路在多發(fā)性硬化發(fā)病中的作用。 方法： 1.以急性復(fù)發(fā)期MS患者(24人)、緩解期MS患者(7人)和正常人(15人)為研究對象。 2.采集外

5、周靜脈血，用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/ml，分兩部分于RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 3.一部分分離的PBMC加或不加CD3和CD28抗體共同刺激24小時(shí)。收集細(xì)胞上清，采用ELISA方法檢測血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL—23和IL-17的水平。 4.提取PBMC中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)IL—23p19、IL-17和內(nèi)參照GAPDH特異性引物。分別應(yīng)用

6、實(shí)時(shí)定量RT—PCR急性復(fù)發(fā)期MS患者、緩解期MS患者和正常人PBMC中IL—23p19 mRNA和IL-17mRNA的表達(dá)。 5.另一部分分離的PBMC，加PMA和ionomycin刺激半小時(shí)后加brefeldin A封閉以抑制細(xì)胞因子的分泌再作用4小時(shí)。然后加FITC標(biāo)記的抗CD3流式抗體和APC標(biāo)記的抗CD4抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色，固定細(xì)胞，破膜，最后加PE標(biāo)記的抗IL-17抗體或相應(yīng)的同型對照抗體。上流式細(xì)胞儀檢測Th17

7、細(xì)胞亞群。 結(jié)果： 1.MS患者和正常人血清中IL—23和IL-17的水平。 結(jié)果表明急性復(fù)發(fā)期MS患者血清中IL—23水平顯著高于緩解期患者和正常人。急性復(fù)發(fā)期MS患者血清中IL-17的水平也高于緩解期患者和正常人，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.MS患者和正常人PBMC中IL—23和IL-17的水平。 結(jié)果顯示，IL—23和IL-17在未刺激的PBMC中水平也較低或檢測不到；一旦經(jīng)抗CD3和CD28

8、抗體刺激后，IL-17水平在MS患者和正常人PBMC中均增高。并且，復(fù)發(fā)期急性階段患者刺激后的PBMC上清中IL—23和IL-17水平顯著高于緩解期患者和正常人。 3.MS患者和正常人IL—23p19和IL-17mRNA表達(dá) 未刺激的PBMC中IL—23p19和lL-17mRNA表達(dá)較低。刺激后IL—23p19和IL-17mRNA表達(dá)明顯升高。并且急性復(fù)發(fā)期MS患者PBMC中IL—23 p19mRNA表達(dá)顯著高于正常人。

9、同樣，急性復(fù)發(fā)期MS患者IL-17 mRNA表達(dá)也顯著高于靜止期MS患者和正常人 4.MS患者和正常人PBMC中Th17細(xì)胞的比例 未刺激的T細(xì)胞極少分泌IL-17，外周血循環(huán)中Th17細(xì)胞數(shù)量較少；一旦經(jīng)PMA和Ionomycin刺激后，Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增加，并且在急性復(fù)發(fā)期患者Th17細(xì)胞明顯地高于緩解期患者和正常人。 結(jié)論： 急性復(fù)發(fā)期MS患者PBMC中IL—23p19 mRNA的表達(dá)增高，急性

10、復(fù)發(fā)期患者血清和PBMC培養(yǎng)上清中IL—23的水平也高于緩解期患者和正常人：同時(shí)，急性復(fù)發(fā)期MS患者血清IL-17的水平增高，刺激后PBMC中IL-17mRNA表達(dá)和IL-17產(chǎn)物也明顯增加；急性復(fù)發(fā)期MS患者外周血循環(huán)中Th17細(xì)胞比例增多，這些結(jié)果說明MS患者中IL—23-Th17細(xì)胞—IL-17通路可能在MS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。 第二部分甲基強(qiáng)的松龍對MS患者Th17細(xì)胞抑制作用的研究 目的： 研究MS發(fā)

11、病過程中甲基強(qiáng)的松龍對Th17細(xì)胞的影響，探討甲基強(qiáng)的松龍?jiān)贛S治療中的作用機(jī)制。 方法： 1.抽取22例未處于急性復(fù)發(fā)期MS患者的外周靜脈血。這些MS患者接受甲基強(qiáng)的松龍連續(xù)治療5天后再次采集外周血。 2.分離用藥前后MS患者外周靜脈血的PBMC，加CD3和CD28抗體共同刺激24小時(shí)后收集上清和細(xì)胞。 3.采用ELISA方法檢測血清和培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞上清中IL-17水平。 4.提取細(xì)胞總RN

12、A，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量RT—PCR檢測IL-17、IL23R和RORγt的mRNA表達(dá)。 5.MS患者用藥前后和正常人PBMC中加入PMA和ionomycin刺激4小時(shí)，最后4小時(shí)加BFA封閉以抑制細(xì)胞因子的分泌，固定細(xì)胞，然后破膜，加FITC標(biāo)記的抗CD3流式抗體、APC標(biāo)記的抗CD4抗體和PE標(biāo)記的抗IL-17抗體或相應(yīng)的同型對照抗體孵育。上流式檢測Th17細(xì)胞。 結(jié)果： 1.MS患者經(jīng)甲基強(qiáng)的松龍治

13、療后，臨床癥狀得到明顯的控制，神經(jīng)功能有不同程度的恢復(fù)，EDSS評分明顯降低。 2.MS患者甲基強(qiáng)的松龍治療后PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平較用藥前顯著降低。 3.MS患者甲基強(qiáng)的松龍治療后PBMC中Th17細(xì)胞的比例顯著降低。 4.MS患者甲基強(qiáng)的松龍治療后IL-17mRNA的表達(dá)顯著降低，并且IL23R和Th17細(xì)胞的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)也顯著降低。 結(jié)論： 我們的研究證

14、實(shí)，急性復(fù)發(fā)期MS患者經(jīng)甲基強(qiáng)的松龍治療后PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平也顯著降低；P8MC中的Th17細(xì)胞比例也顯著下調(diào)。并且PBMC中IL23R和RORγt的mRNA表達(dá)也明顯被抑制。這些結(jié)果說明甲基強(qiáng)的松龍治療可以有效的抑制Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17從而控制MS患者的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并且可能通過阻斷IL23R和RORγt的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對Th17細(xì)胞的抑制作用。 第三部分IL-23及其受體基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化相關(guān)性的

15、研究 目的： 探討IL—23亞單位及IL—23受體亞單位基因單核苷酸多態(tài)性與MS遺傳易患性的相關(guān)性，從遺傳學(xué)角度探討MS發(fā)生的危險(xiǎn)因素。 研究對象和方法： 1.以臨床確診的150例MS患者和157例正常人為研究對象，采集外周靜脈血，提取基因組DNA； 2.采用PCR—RFLP法檢測IL12B基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs3212227和IL—23R基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10889677，rs220

16、1841和rs7517847的基因型。計(jì)算基因型和等位基因頻率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析； 3.進(jìn)一步對IL—23R基因3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)之間進(jìn)行連鎖不平衡和單倍體型分析。 結(jié)果： 1.CMS患者IL-12B基因rs3212227位點(diǎn)A等位基因頻率高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。攜帶A等位基因增加MS發(fā)病的危險(xiǎn)性。 2.IL23R基因3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率同對照組比較，差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

17、 3.IL23R基因單核苷酸多態(tài)性rs10889677和rs2201841位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡狀態(tài)。 4.rs10889677位點(diǎn)T等位基因、rs2201841位點(diǎn)C等位基因和rs7517847位點(diǎn)T等位基因構(gòu)成的單倍體TCT在MS患者和CMS患者中分布頻率均顯著低于對照組。 5.CCT和TAT單倍體在CMS患者中分布頻率均顯著高于對照組。 結(jié)論： 1、IL—23亞單位基因單核苷酸多態(tài)性rs321