HBx蛋白與肝細(xì)胞脂肪變性的可能關(guān)系及機制.pdf

1、目的：HBV感染是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。全球約3.5億人為HBV慢性感染,每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌。近年來脂肪性肝病的發(fā)病率逐年增加,目前已成為我國乃至亞太地區(qū)僅次于CHB的第二大肝病。脂肪肝可誘發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)的生成,導(dǎo)致脂肪性肝纖維化和或肝硬化的發(fā)生。文獻(xiàn)報道有27％-51％的CHB合并脂肪肝,高于普通人群脂肪肝的發(fā)病率。因此,HBV是否參與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展,已成為肝病領(lǐng)域研究的熱點。本實驗擬從

2、臨床和基礎(chǔ)兩個層面探討HBx蛋白與脂肪肝的關(guān)系及可能機制。
　　 方法：⑴對經(jīng)病理證實的18例CHB以及18例CHB合并脂肪肝的住院患者進(jìn)行性別、年齡、血脂、空腹血糖、肝功能、血清病毒學(xué)指標(biāo)分析。⑵免疫組化觀察肝組織HBsAg、HBcAg、HBx、LXRa及FAS蛋白的表達(dá)。Image-Pro Plus5.0軟件分別定量測定HBsAg、HBcAg、HBx,LXRα及FAS蛋白的平均光密度(mean density)值。⑶MTT比

3、色法篩選油酸鈉最佳作用濃度及作用時間。⑷油紅O染色檢測HepG2.2.15及HepG2細(xì)胞的脂變程度;測定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量；Western blot檢測HBx、LXRα及FAS蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①CHB與CHB合并脂肪肝病例在性別(P>0.05)、年齡(P>.05)、TG(P>0.05)、CHOL(P>0.05)、ALT(121.75±115.33 vs123.49±102.57,P>0.05)、AST(63.51±

4、32.85 vs57.17±37.46,P>0.05)、空腹血糖(5.30±0.40 vs5.50+0.35,P>0.05)、HBsAg陽性率(100％ vs100％,P>0.05)、HBsAb陽性率(0 vs0,P>0.05)、HBeAg陽性率(38.89％ vs27.78％,P>0.05)、HBeAb陽性率(55.56％ vs55.56％,P>0.05)、HBcAb陽性率(100％ vs100％,P>0.05)、HBV-DNA載量(

5、1.52*107±2.45*107 vs1.71*107±1.62*107,P>0.05)各項指標(biāo)無明顯差異；兩組肝組織炎癥活動度分級及纖維化程度分期的構(gòu)成比無顯著差異(P>0.05)；18例CHB合并脂肪肝病例的肝脂變程度以輕.中度脂變?yōu)橹?與慢性肝炎炎癥活動度分級(P>0.05)及纖維化程度分期(P>0.05)無關(guān)。②免疫組化結(jié)果顯示HBsAg在肝細(xì)胞胞漿中表達(dá),HBcAg主要在肝細(xì)胞細(xì)胞核表達(dá)。CHB合并脂肪肝組及CHB組HBsA

6、g、HBcAg表達(dá)陽性率均為100％,P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組HBsAg(t=1.50,P>0.05)、HBcAg(t=0.95,P>0.05)的表達(dá)強度,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。HBx(77.78％ vs83.33％)、LXRα(77.78％ vs88.89％)、FAS(83.33％vs88.89％)的表達(dá)陽性率在CHB與CHB合并脂肪肝組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。但是HBx(0.19±0.08 vs0.25±0.09

7、)、LXRα(0.16±0.01 vs0.21±0.03)、FAS(0.17±0.02 vs0.26±0.07)的表達(dá)強度在CHB合并脂肪肝組明顯高于CHB組(P<0.05),且HBx在CHB合并脂肪肝組胞漿及胞核中的表達(dá)強度均明顯高于CHB組,P<0.05；相關(guān)性檢驗分析提示HBsAg與LXRα、FAS(r=0.33,r=0.37,P>0.05),HBcAg與LXRα、FAS(r=0.35,r=0.26,P>0.05)表達(dá)無相關(guān)性。而

8、HBx與LXRα、FAS(r=0.76,0.68,P<0.05)表達(dá)呈正相關(guān)。③HepG2.2.15及HepG2細(xì)胞的脂變模型建立成功：根據(jù)MTT結(jié)果,油酸鈉最佳誘導(dǎo)濃度為40μg/ml,最佳作用時間段為24h、48h及72h；油紅O染色:在未加油酸鈉處理的情況下,HepG2.2.15細(xì)胞及HepG2細(xì)胞各時間段僅見極少量橘紅色脂滴,但是HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)脂滴多于HepG2細(xì)胞。油酸鈉處理后,各組細(xì)胞內(nèi)的脂滴隨著處理時間的延長逐

9、漸增加,并有不同程度的融合。然而HepG2.2.15細(xì)胞各組的脂滴均明顯多于HepG2細(xì)胞組；TG含量測定:在未加油酸鈉處理的情況下,HepG2.2.15細(xì)胞TG含量高于HepG2細(xì)胞(P<0.05)。油酸鈉處理后,HepG2.2.15細(xì)胞及HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量均呈時間依賴性增加,且HepG2.2.15細(xì)胞在24、48、72h的TG含量均比同一時間段HepG2增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。④HBx蛋白的表達(dá):HBx蛋白在H

10、epG2.2.15細(xì)胞中有表達(dá),而在HepG2細(xì)胞中表達(dá)為陰性,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。⑤LXRa及FAS蛋白的表達(dá):未處理組HepG2.2.15LXRα及FAS蛋白表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞組(P<0.05)。油酸鈉處理后,HepG2.2.15細(xì)胞LXRα及FAS蛋白在24h、48h、72h均比HepG2細(xì)胞同一時間段的表達(dá)明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：HBx可能通過誘導(dǎo)LXRα進(jìn)而刺激FA