荔枝果肉不同酚類成分群體外抑制肝細(xì)胞脂肪變性的活性差異及其機(jī)制研究.pdf

1、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是亞熱帶地區(qū)的主要特色水果，其果肉營(yíng)養(yǎng)豐富，我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為荔枝具有健脾、益肝和美容之功效?，F(xiàn)代研究表明荔枝果肉富含酚類物質(zhì)，具有顯著的抗氧化活性，且對(duì)高脂負(fù)荷小鼠脂質(zhì)代謝紊亂具有明顯的改善作用，但實(shí)驗(yàn)采用的都是含有多種酚類物質(zhì)的混合提取物，其有效的酚類成分尚不明確。為此，本研究將荔枝果肉多酚提取物分離成不同的酚類成分群，比較不同酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量、單體酚組成及抗氧

2、化活性差異;通過(guò)體外肝細(xì)胞脂肪變性模型，比較荔枝果肉不同酚類成分群對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集的抑制作用差異，在此基礎(chǔ)上，明確荔枝果肉改善肝細(xì)胞脂肪變性的最主要酚類物質(zhì);結(jié)合real time RT-PCR和western blot等分析技術(shù)，進(jìn)一步探討荔枝果肉主要酚類物質(zhì)改善肝細(xì)胞脂肪變性的分子機(jī)制及主要信號(hào)通路。主要研究結(jié)果如下:
　　1.荔枝果肉不同酚類成分群的分離鑒定及抗氧化活性比較
　　采用C18硅膠層析柱將荔枝果肉多酚提取物

3、可分為F1、F2、F3和F4共4個(gè)酚類成分群，其中F2的得率高達(dá)36％，其他成分群得率分別為18.71％、16.79％、21.12％;各酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量分別介于218.86-499.78 mg GAE/gDW、414.94-1285.45 mg RE/g DW、83.35-483.43 mg CE/g DW。4個(gè)成分群中F2的總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，對(duì)荔枝果肉多酚提取物相應(yīng)的總量貢獻(xiàn)率最大，分別達(dá)50.3％

4、、54.2％、72.1％，均高于其余3個(gè)成分群的貢獻(xiàn)率;其次是F3和F4; F1的最低。經(jīng)HPLC-DAD和LC-ESI-MS分析和鑒定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2成分群主要為原花青素B2、表兒茶素、A-型原花青素三聚體、B-型原花青素三聚體、B-型原花青素二聚體等單體酚，F(xiàn)3僅含槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷一種單體酚，F(xiàn)4中含有蘆丁、山奈酚-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷和異鼠李素-蕓香糖苷等。4個(gè)酚類成分群的FRAP

5、抗氧化能力大小順序?yàn)镕2＞F3＞F4＞F1(p＜0.05);DPPH消除能力的IC50值分別為27.00、9.76、19.41、16.25μg·mL-1，其中F2的IC50值最小，即DPPH消除能力最強(qiáng)，其次是F4、F3，F(xiàn)1最弱;ORAC抗氧化能力順序?yàn)镕2＞F3＞F4＞F1(p＜0.05)，CAA抗氧化能力順序?yàn)镕2＞F3＞F4≈F1(p＜0.05)，其中F2的ORAC和CAA抗氧化能力分別為8.36 mmol TE/g DW和19

6、0.71μmol QE/gDW，對(duì)荔枝果肉多酚提取物ORAC和CAA值的貢獻(xiàn)率分別高達(dá)50.4％和84.9％。由此可見，荔枝果肉4個(gè)酚類成分群間的總酚、總黃酮和縮合單寧含量及抗氧化活性均存在顯著差異，各成分群的單體酚組成亦各有特點(diǎn)，其中F2成分群的得率及總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，抗氧化活性最好，是荔枝果肉抗氧化作用的最主要酚類物質(zhì)。
　　2.荔枝果肉不同酚類成分群體外抑制肝細(xì)胞脂肪變性的活性差異研究
　　以油酸誘導(dǎo)人肝

7、癌HepG2細(xì)胞發(fā)生脂肪沉積，建立體外肝細(xì)胞脂肪變性模型。比較不同濃度油酸(OA)誘導(dǎo)下HepG2細(xì)胞甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平以及丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果表明，油酸濃度不高于0.4 mmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量顯著升高，呈現(xiàn)劑量依賴性，且ALT、AST水平以及MDA含量和SOD活性無(wú)明顯變化，未引起細(xì)胞損傷。因此，以0.4 mmol/L

8、油酸為誘導(dǎo)劑，建立單純性肝細(xì)胞脂肪變性模型。探討4個(gè)酚類成分群對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用，結(jié)果表明，5-40μg/mL濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)1、F2、F3和F44個(gè)酚類成分群中F2成分群抑制細(xì)胞內(nèi)TG沉積的效果最好，5μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG的抑制率高達(dá)26.9％。F3的抑制作用僅次于F2的，10μg/mL時(shí)細(xì)胞內(nèi)TG含量下降了26.2％。F4的抑制效果相對(duì)較弱，20μg/mL時(shí)才達(dá)到最大抑制率為19.3％。而F1的抑制效果最

9、差，濃度達(dá)到40μg/mL時(shí)才具有一定抑制作用，抑制率僅為11％。各酚類成分群對(duì)細(xì)胞內(nèi)TC含量的抑制作用大小與TG的結(jié)果一致，亦為F2＞F3＞F4＞F1(p＜0.05)。此外，研究各成分群的復(fù)配作用，結(jié)果表明F2和F3顯示出協(xié)同抑制肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的作用，而F4未顯示出對(duì)F2和F3的協(xié)同作用。由此提示F2和F3成分群是荔枝果肉改善肝細(xì)胞脂肪變性的主要酚類物質(zhì)。
　　3.荔枝果肉主要酚類物質(zhì)體外抑制肝細(xì)胞脂肪變性的作用機(jī)制研究

10、>　　荔枝果肉酚類成分群F3僅含槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷(QRR)一種單體酚，是荔枝果肉改善肝細(xì)胞脂肪變性的最主要酚類物質(zhì)之一，則以QRR為研究對(duì)象，采用體外HepG2細(xì)胞脂肪變性模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、油酸模型組以及不同濃度QRR組。用real time RT-PCR和western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，QRR能顯著降低肝臟清道夫受體CD36、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（FATP-

11、2）的mRNA水平和FATP-2的蛋白表達(dá)(p＜0.05)，減少肝細(xì)胞對(duì)外源性脂肪酸的吸收，并呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢(shì);各劑量組均能降低甘油三酯合成的關(guān)鍵酶二酯酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT1和DGAT2）基因的mRNA水平以及DGAT1的蛋白表達(dá)水平(p＜0.05)，但對(duì)DGAT2的蛋白表達(dá)影響不顯著;QRR還可促使腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化，活化過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα），上調(diào)脂肪酸氧化的相關(guān)基因如肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-

12、1α(CPT-1α)的表達(dá)，但對(duì)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-c(SREBP1-c)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)等脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。此外，采用CompoundC抑制AMPK的激活，QRR抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的作用仍然存在，表明QRR改善肝細(xì)胞脂肪變性的作用途徑不是完全依賴于AMPK信號(hào)通路。綜述所述，QRR改善肝細(xì)胞脂肪變性的作用機(jī)制主要是調(diào)節(jié)脂肪酸吸收、氧化以及甘油三酯合成的相關(guān)基因和蛋白表