荔枝果皮多酚氧化酶內(nèi)源底物的確定及其促褐變機(jī)制.pdf

1、荔枝是一種具有高商業(yè)價(jià)值的亞熱帶水果，但其果皮在采后的快速褐變導(dǎo)致其商品價(jià)值降低。本研究從尋找荔枝表皮內(nèi)源底物的角度出發(fā)，在對(duì)荔枝表皮中主要的黃烷醇類(lèi)化合物進(jìn)行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定和對(duì)荔枝表皮PPO分離純化的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究荔枝表皮內(nèi)源底物與PPO的相互作用關(guān)系，及其在花色苷降解過(guò)程中的作用，進(jìn)一步闡明荔枝表皮酶促褐變的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、經(jīng)HPLC-MS，NMR，CD等現(xiàn)代分析方法分析表明，荔枝中主要的黃烷醇類(lèi)化

2、合物為(-)表兒茶素，原花青素B2，原花青素A2和原花青素A型三聚體表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素。且不同品種的荔枝表皮中主要的黃烷醇種類(lèi)基本相同的，只是各化合物的含量略有差異。
　　 2、本研究建立了一種通過(guò)柱層析分離制備高純度荔枝表皮PPO的新方法，該方法有效地提高了荔枝表皮PPO分離純化的得率和純度。研究還表明本研究分離得到的荔枝表皮PPO為一種糖含量為50.0％的糖蛋白，SDS-聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得其相對(duì)分子量為94.0kDa，其結(jié)構(gòu)中可能含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
　　 3、通過(guò)底物特異性和動(dòng)力學(xué)分析，首次確定了荔枝表皮PPO的最適內(nèi)源底物為(-)-表兒茶素，且PPO對(duì)該底物有很強(qiáng)的親和力。反應(yīng)體系的pH值對(duì)(-)-表兒茶素酶促氧化反應(yīng)有很大影響。該酶促氧化是從PPO催化氧化（-）-表兒茶素生成相應(yīng)的（-）-表兒茶素醌的反應(yīng)開(kāi)始，再由(-)-表兒茶素的C-8親核攻擊(-)-表兒茶素醌的B環(huán)，通過(guò)Michae

4、l-加成反應(yīng)生成無(wú)色的脫氫二聚表兒茶素B。在pH值小于5.5的情況下，脫氫二聚表兒茶素B再被氧化生成黃色的脫氫二聚表兒茶素A，而在pH值大于7.0的情況下，脫氫二聚表兒茶素B則被氧化成脫氫二聚表兒茶素醌衍生物。另外，在pH5.5～7.0的情況下，脫氫二聚表兒茶素A和脫氫二聚表兒茶素醌衍生物同時(shí)生成，即脫氫二聚表兒茶素B被氧化為脫氫二聚表兒茶素A和脫氫二聚表兒茶素醌衍生物的反應(yīng)同時(shí)發(fā)生。
　　 4、以（-）-表兒茶素為底物研究了荔

5、枝表皮PPO的酶學(xué)特性，研究表明，以（-）-表兒茶素為底物時(shí)荔枝表皮PPO活性的最適pH值為7.5，最適溫度為45℃。PPO在pH值小于4.5的環(huán)境中不穩(wěn)定，而在pH6.0-8.0的環(huán)境中穩(wěn)定。同時(shí)，研究還表明在45℃以上，PPO不穩(wěn)定，且PPO的變性溫度在70℃附近。
　　 5、本研究所用抑制劑除Vc外，均對(duì)PPO催化的（-）-表兒茶素和荔枝表皮黃烷醇提取物的氧化反應(yīng)時(shí)具有顯著的抑制效果，且同種抑制劑在抑制這兩個(gè)反應(yīng)時(shí)的抑制效

6、果相近，這說(shuō)明同一種抑制劑對(duì)這兩個(gè)反應(yīng)的抑制機(jī)制相似。因此，我們推測(cè)只要能有效抑制(-)-表兒茶素的酶促氧化就能有效抑制荔枝表皮黃烷醇類(lèi)化合物的酶促氧化。(-)-表兒茶素的酶促氧化可能是引起黃烷醇類(lèi)化合物氧化的起因。
　　 6、L-谷胱甘肽和L-半胱氨酸對(duì)PPO活性的抑制可能是兩種抑制途徑共同作用的結(jié)果：1．它們直接與PPO作用而抑制其活性；2．它們可以與醌形成無(wú)色的結(jié)合產(chǎn)物從而抑制酶活。Vc對(duì)PPO活性的抑制可能僅僅取決于它的

7、還原能力。NaF對(duì)PPO活性的抑制作用可能是由于其本身可以直接與PPO作用而抑制其活性。雖然L-谷胱甘肽和L-半胱氨酸都對(duì)（-）-表兒茶素的酶促氧化有很好的抑制效果，但是，這種效果是暫時(shí)的，從長(zhǎng)期效果來(lái)看，它們都不能很好的抑制(-)-表兒茶素酶促氧化。隨著這些抑制劑在與酶促氧化生成的(-)-表兒茶素醌的反應(yīng)中被消耗，有顏色的化合物就開(kāi)始形成。同時(shí)，研究還表明，L-谷胱甘肽與（-）-表兒茶素醌反應(yīng)生成無(wú)色的加成產(chǎn)物，而L-半胱氨酸與(-)

8、-表兒茶素醌反應(yīng)生成有顏色的加成產(chǎn)物。
　　 7、矢車(chē)菊素-3-蕓香糖苷在僅有荔枝表皮PPO存在的情況下不會(huì)發(fā)生明顯的降解，但在有(-)-表兒茶素和荔枝表皮PPO同時(shí)存在的情況下快速降解。根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，荔枝表皮中的花色苷的降解機(jī)制如下：荔枝表皮PPO先氧化（-）-表兒茶素形成（-）-表兒茶素醌，該物質(zhì)再通過(guò)耦合氧化機(jī)制進(jìn)一步導(dǎo)致花色苷的降解。研究結(jié)果還表明，花色苷和（-）-表兒茶素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)與(-)-表兒茶素醌反應(yīng)，且這

9、種競(jìng)爭(zhēng)與(-)-表兒茶素和花色苷的濃度有關(guān)。
　　 8、對(duì)荔枝采后貯藏過(guò)程中酚類(lèi)化合物的變化的研究表明，荔枝表皮褐變?cè)诶笾Ρ砥つすδ苌⑹Ш蟛虐l(fā)生，此時(shí)，荔枝表皮中主要的黃烷醇類(lèi)化合物以及花色苷含量都明顯降低。而在膜功能散失前，荔枝表皮中主要的黃烷醇類(lèi)化合物以及花色苷含量保持不變，且荔枝表皮未發(fā)生褐變。這說(shuō)明荔枝表皮膜功能散失之后，（-）-表兒茶素與PPO結(jié)合，反應(yīng)產(chǎn)生(-)-表兒茶素醌，該物質(zhì)再與荔枝表皮中的黃烷醇類(lèi)化合物，花色