木豆活性成分Cajanol體外抗腫瘤活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、木豆是豆科木豆屬一年生或多年生木本植物,無毒可食用,具有很多藥理活性。Cajanol是從木豆根中提取分離得到的單體化合物,是一種黃酮類化合物。Cajanol也是一種植物抗生素,具有抗瘧原蟲活性和抗真菌活性,其他活性目前未有報(bào)道。通過對Cajanol體外抗腫瘤活性進(jìn)行初步評價(jià),發(fā)現(xiàn)其具有很好的腫瘤抑制作用,具有一定的開發(fā)前景。本論文主要對Cajanol的體外抗腫瘤活性及作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。為Cajanol抗腫瘤新藥的研制提供一定的科學(xué)依

2、據(jù)。
　　 研究結(jié)果如下:
　　 1.應(yīng)用MTT法研究Cajianol對腫瘤細(xì)胞株生長的影響,結(jié)果Caianol對幾種腫瘤細(xì)胞株均有不同程度的生長抑制作用,人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)的IC50為19.594±1.07μg/mL;人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)的IC50為19.37±0.94μg/mL,人肺腺癌細(xì)胞(A549)的IC50為19.9±1.10μgmL,人卵巢癌(HO-8910)的IC50為18.00±0.55μg

3、/mL;人白血病(CCRF-CEM)細(xì)胞的IC50為18.36±1.18μg/mL;人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的IC50為17.08±0.69μg/mL。其中對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。Caianol對正常細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)的IC50為34.26±1.52μg/mL。
　　 2.采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA Ladder,片段化而形成的DNA Ladder被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的典型特征,經(jīng)過10μg/m

4、L,和20μg/mL Cajianol處理的MCF-7細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)明顯的DNALadder,所以Cajanol可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 3.采用熒光顯微鏡,檢測經(jīng)過Hochest33258染色的細(xì)胞核形態(tài)變化,未經(jīng)處理的細(xì)胞核大而圓,染色均一,淺藍(lán)色;20μg/mL Cajianol處理MCF-7細(xì)胞48 h的細(xì)胞核染色質(zhì)濃集、邊聚,核碎裂,并可見凋亡小體。凋亡小體是細(xì)胞凋亡的主要特征之一,說明Cajanol可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞

5、凋亡。
　　 4.采用Annexin V-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測了Cajanol誘導(dǎo)MCF-7腫瘤細(xì)胞凋亡百分率的變化,經(jīng)過Cajanol處理MCF-7細(xì)胞后,會引起腫瘤細(xì)胞凋亡,并在一定的劑量范圍內(nèi),隨著Cajanol藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡百分率也逐漸提高。
　　 5.利用流式細(xì)胞儀分析了Cajianol處理MCF-7細(xì)胞后對細(xì)胞周期的影響,結(jié)果不同濃度的Cajanol在作用MCF-7細(xì)胞48 h后,

6、細(xì)胞周期發(fā)生了改變。G2/M期細(xì)胞發(fā)生大量滯留的現(xiàn)象,并且隨著劑量的增加,這種變化愈加明顯。因此,Cajanol能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡,與引起G2/M期細(xì)胞大量積累有關(guān)。
　　 6.采用Rh123染色,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Cajanol對MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位(△ψm)變化的影響。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞經(jīng)過Cajanol作用后,隨著時(shí)間延長,低熒光強(qiáng)度部分細(xì)胞所占百分比逐漸增加,高于對照組。說明發(fā)生△ψm去極化,△

7、ψm降低。此結(jié)果也說明Cajanol可能通過降低△ψm而引起MCF-7細(xì)胞凋亡。
　　 7.采用DCFH-DA熒光探針,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Cajanol對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。隨著Cajanol給藥量的增加,流式細(xì)胞儀所檢測的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),說明Cajanol可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS,并隨著濃度的增加,ROS產(chǎn)生量也逐漸增加。
　　 8.采用BCECF AM熒光探針,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測Cajanol對MCF-7細(xì)胞

8、內(nèi)pH的影響。隨著Cajanol給藥量的增加,細(xì)胞的平均熒光密度逐漸降低,說明經(jīng)Cajanol處理的MCF-7細(xì)胞,胞漿pH([pH]i)降低,并且隨著劑量的增加,這種變化愈加明顯。
　　 9.通過Western blot檢測,結(jié)果顯示Cajanol通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),上調(diào)Bax蛋白的表達(dá),促使Cytochrome C大量從線粒體向細(xì)胞質(zhì)中釋放,細(xì)胞質(zhì)中的Cytochrome C可以將47kD的蛋白pro-caspas

9、e-9激活為37kD的active-caspase-9,而active-caspase-9又可以將35kD的蛋白pro-caspase-3被激活為17kD和12kD的active-caspase-3,active-caspase-3剪切PARP,從而完成Cajanol誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的信號通路。
　　 綜上所述,Cajanol在不影響正常細(xì)胞生長的情況下,可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,這種抑制作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。Cajan