鹿茸活性成分的提取分離及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：鹿茸是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有廣泛的藥理學(xué)活性。鹿茸作為一種特殊的軟骨，是一個天然的細胞因子庫，其中含有大量的蛋白質(zhì)及蛋白多糖。近年來大量研究證明，蛋白多糖具有抗腫瘤作用，而以往對鹿茸的研究主要是醇提物，其中蛋白質(zhì)和多糖類水溶性物質(zhì)研究較少，對其水溶性物質(zhì)進行系統(tǒng)的抗腫瘤研究更是鮮見，因此本研究通過緩沖液提取出水溶性蛋白質(zhì)及蛋白多糖，系統(tǒng)的研究鹿茸水溶性提取物的抗腫瘤作用及其機理，同時研究鹿茸中蛋白多糖與化療藥物聯(lián)合用藥時的抗腫瘤效

2、果并將其與鹿茸粗提物的抗腫瘤效果進行比較。 方法：利用Tris緩沖液提取出鹿茸中水溶性成分，并分別用Braldford法和天青工法檢測其中蛋白質(zhì)及蛋白多糖含量；采用DEAE Sepharose FF陰離子交換樹脂分離出水溶性提取物中的蛋白多糖，Bradford法和天青I法示蹤檢測洗脫液中蛋白質(zhì)和蛋白多糖，根據(jù)洗脫曲線濃縮收集蛋白多糖組分，SDS聚丙酰胺凝膠電泳鑒定分離效果，凍干提取分離物；建立移植性S<,180>肉瘤模型，隨機將

3、植瘤鼠分為7組，分別為陰性對照組(陰性對照組)，陽性對照組(環(huán)磷酰胺，25mg/kg)，鹿茸蛋白多糖低劑量組(40mg/kg)、中劑量組(80mg/kg)、高劑量組(160mg/kg)，鹿茸粗提物組(400mg/kg)，聯(lián)合用藥組(蛋白多糖80mg/kg+環(huán)磷酰胺25mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥10d，陰性對照組灌胃生理鹽水，陽性對照組隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺，第11d脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤組織和脾，制備腹腔巨噬細胞懸液和脾淋巴細胞懸液，巨

4、噬細胞吞噬中性紅實驗，T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，體內(nèi)抑瘤活性及生命延長率，稱重瘤組織和脾，計算抑瘤率和脾指數(shù)。 結(jié)果：經(jīng)檢測鹿茸頂部蛋白質(zhì)含量占鹿茸干重13.13％，蛋白多糖占鹿茸干重1.67％。離子交換層析在NaCl濃度為0.7mol/L，0.8mol/L，0.9mol/L時出現(xiàn)洗脫峰，經(jīng)濃縮收集得到三個蛋白多糖組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其蛋白多糖含量分別占總蛋白多糖含量的45.25％、25.15％、18.26％，蛋白多糖提取率為88.6

5、6％。移植性腫瘤S<,180>免疫調(diào)節(jié)試驗結(jié)果表明，灌服蛋白多糖高劑量、鹿茸粗提物及聯(lián)合用藥荷瘤鼠各組間日增重?zé)o顯著差異，脾指數(shù)，T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，巨噬細胞吞噬中性紅功能均高于陰性對照組(P<0.05)；蛋白多糖高劑量組荷瘤鼠T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，巨噬細胞吞噬中性紅功能高于陽性對照組(P<0.05)，脾指數(shù)無顯著差異；鹿茸粗提物組荷瘤鼠的巨噬細胞吞噬功能和T淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力高于陽性對照組(P<0.05)，B淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能和脾指

6、數(shù)與陽性對照組間無顯著差異；聯(lián)合用藥組荷瘤鼠脾指數(shù)，T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能均高于蛋白多糖中劑量組和陽性對照組，但僅T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能有顯著差異(P<0.05)。移植性腫瘤S<,180>抑制試驗結(jié)果表明，鹿茸粗提物組抑瘤率(78.15％)與陽性對照組(39.87％)間存在極顯著差異(P<0.01)，聯(lián)合用藥組體內(nèi)抑瘤率(50.16％)高于陽性對照組和蛋白多糖中劑量組(-23.07％)，但與陽性對照組間不存在顯著差異；蛋白多糖高劑量組抑瘤率

7、(23.47％)低于30％；生命延長率方面蛋白多糖高劑量組(119.79％)、鹿茸粗提物組(119.79％)均高于陽性對照組(41.67％)，但無顯著差異；聯(lián)合用藥組生命延長率(212.50％)高于蛋白多糖中劑量組(103.13％)和陽性對照組，且與陽性對照組間有極顯著差異(P<0.01)。 結(jié)論：鹿茸頂部蛋白質(zhì)含量占鹿茸干重的13.13％；蛋白多糖含量占鹿茸干重1.67％；利用DEAE Sepharose F.F陰離子交換層析

8、能快速分離出鹿茸中蛋白多糖，此法相對快速，簡便；通過移植腫瘤S<,180>抑制試驗發(fā)現(xiàn)，鹿茸粗提物對荷瘤小鼠的抑瘤效果最好，抑瘤率達78.15％；聯(lián)合用藥組荷瘤鼠的生命延長率最高，達212.50％；移植腫瘤S<,180>免疫調(diào)節(jié)試驗發(fā)現(xiàn)，蛋白多糖各劑量組對荷瘤鼠的免疫調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)一定劑量依賴關(guān)系，且蛋白多糖劑量達160mg/kg時，其免疫調(diào)節(jié)作用強于鹿茸粗提物和聯(lián)合用藥；蛋白多糖的免疫調(diào)節(jié)功能強于鹿茸粗提物；蛋白多糖與化療藥物聯(lián)用可增強