海帶（Laminaria japonica Aresch）多酚的提取、分離及其抗腫瘤、抗菌活性研究.pdf

1、植物多酚與人類的生活息息相關(guān)，作為一類具有多種生物活性的天然物質(zhì)，它對(duì)人的消化、營(yíng)養(yǎng)、健康產(chǎn)生影響，已在食品、藥品、化妝品等工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。本論文以鮮海帶(Laminaria japonica Aresch)為原料，系統(tǒng)地研究了海帶多酚(KP)的制備、分離純化、抗腫瘤、抑茵活性，并初步探討了其理化性質(zhì)和作用機(jī)理，為深入研究海藻多酚提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為海帶的高值化利用及新的抗腫瘤藥物、食品保鮮劑的開發(fā)提供一種新的思路。

2、 本論文的研究?jī)?nèi)容包括以下6個(gè)部分： 1.海帶多酚提取率測(cè)定方法的選擇： 海帶可以綜合利用提取多酚和其它副產(chǎn)物。通過(guò)酒石酸鐵比色法和Folin-Denis法兩種多酚定量分析方法的比較，表明以沒食子酸丙酯為參照物的酒石酸鐵比色法方便、快速、可靠，可以作為本次實(shí)驗(yàn)定量分析手段。另外，在同樣的提取條件下，鮮海帶總酚含量要比干海帶的總酚含量略高。 2.海帶多酚提取工藝條件的優(yōu)化： 采用鮮海帶為原料，以超聲波、微波

3、復(fù)合浸提為前處理手段，以多酚的提取率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)KP浸提工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：采用料液比1:7(g/mL)，乙醇濃度85％，浸提溫度70℃，浸提次數(shù)2次，浸提時(shí)間4h，提取效果最佳，KP提取率為2.08％。 3.海帶多酚粗提物抗腫瘤、抗菌活性的研究： 以MTT法分別測(cè)定了KP粗提物對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞、鼠白血病P388細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞和人宮頸癌Hela細(xì)胞的抗腫瘤活

4、性；以平板打孔抑制法分別測(cè)定了KP粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、痢疾志賀菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、白色念珠菌、青霉、灰霉、黃曲霉的抑菌活性。結(jié)果表明：KP粗提物具有一定的抗腫瘤活性，在100μg/mL時(shí)，對(duì)A549、P388、BEL-7402、Hela細(xì)胞的抑制率分別為27.404±4.71％，43.444±1.86％，30.20±1.16％，29.68±2.61％。鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)都發(fā)生不同程度的變化。

5、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性量效關(guān)系表明KP對(duì)P388的IC50為120μg/mL，對(duì)BEL-7402的IC50大于200μg/mL，細(xì)胞毒作用呈劑量和時(shí)間依賴性，對(duì)P388的抑制活性要高于對(duì)BEL-7402的抑制活性。抑菌實(shí)驗(yàn)也顯示KP具有廣譜抗微生物性能，對(duì)供試的2種革蘭氏陽(yáng)性菌和5種革蘭氏陰性菌都有一定程度的抑制活性，量效關(guān)系均呈劑量依賴型，最小抑菌濃度(MIC)為10μg/mL～40μg/mL。另外，多酚對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌中的大腸桿菌、

6、綠膿桿菌抑制效果較明顯，對(duì)真菌如青霉、白色念珠菌亦有抑制作用。 4.海帶多酚的分離純化及其各部分活性檢測(cè)： 利用有機(jī)溶劑萃取分離、AB-8大孔樹脂吸附分離、SephadexLH-20凝膠層析等技術(shù)對(duì)KP進(jìn)行分離純化，最后得到4個(gè)峰組分，分別為Al、A2、B1、B2，并篩選出了具有較高活性的多酚組分。各組分腫瘤抑制活性大小依次為：A2>A1>B2>B1，濃度為70.42μg/mL，組分A2對(duì)BEL-7402和P388的抑制

7、率分別為61.96±7.02％，40.474±8.70％；各組分的抑菌活性大小依次為：A2>B2>A1>B1，在酚濃度為70.42μg/mL、45.68μg/mL的條件下，對(duì)4種菌均有抑制效果且比粗提物和樹脂分離產(chǎn)物同等濃度下抑菌圈直徑大。 5.海帶多酚理化性質(zhì)初步研究： 對(duì)KP的物理化學(xué)性質(zhì)如溶解性、折光率、特征顯色反應(yīng)、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及光譜特征進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明：KP易溶于中極性溶劑，而在非極性溶劑和極性

8、溶劑中溶解性較差；在不同溶劑中的折光率大小依次為乙酸乙酯>乙醇>丙酮>甲醇>水>氯仿=乙醚；特征顯色反應(yīng)表明KP具有酚類物質(zhì)的共性。另外，KP在pH2.0～12.0和40～100℃的范圍內(nèi)都有腫瘤抑制活性，具有良好的prt穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。組分A2與PG、間苯三酚的紫外吸收譜圖具有相似之處。組分A1、A2、B2與PG、連苯三酚的紅外譜圖都具有明顯的酚羥基伸縮振動(dòng)；都有芳香環(huán)骨架伸縮振動(dòng)；在指紋區(qū)都有酚的特征吸收峰，在官能團(tuán)區(qū)也較為相似，

9、初步推斷KP具有PG或連苯三酚相近或相似的結(jié)構(gòu)。 6.海帶多酚的抗腫瘤活性和抗菌活性機(jī)理初步探討： 以顯微鏡觀察藥物處理前后細(xì)胞的形態(tài)變化，考察了多酚對(duì)自由基、致癌物的清除能力；以流式細(xì)胞術(shù)分析了多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡率及對(duì)細(xì)胞增殖周期的影響，并測(cè)定了菌體系統(tǒng)的紫外吸收變化。結(jié)果表明：KP處理P388和BEL-7402細(xì)胞48h后，鏡檢細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化，與正常對(duì)照組差異顯著；在100μg/mL的濃度下，KP具有一定的清