蛤蚧蛋白分離提取及其抗腫瘤分子機制研究.pdf

1、弟一部分蛤蚧蛋白的分離提取
　　目的：從蛤蚧組織中提取蛋白質(zhì)并分離、純化成不同分子量的蛋白組分。
　　方法：將新鮮蛤蚧組織剪碎、勻漿，反復(fù)凍融3次后高速低溫離心，取上清液經(jīng)過濾、超濾、冷凍干燥等方法獲得蛤蚧蛋白粗提物。將粗提物溶解、離心，取上清液通過SephadexG-50凝膠層析進(jìn)一步純化分離，根據(jù)分離曲線收集不同分子量的蛤蚧蛋白組分，用紫外分光光度計和SDS-PAGE電泳等方法分析各組蛋白的含量及分子量。
　　結(jié)果

2、：所提取的蛤蚧蛋白粗提物經(jīng)SephadexG-50凝膠層析分離后主要得到三個蛋白質(zhì)峰，收集三個峰的蛤蚧蛋白組分，分別命名為A組、B組、C組。A組含量為44.8mg，B組含量為206.18mg，C組含量為126.38mg。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示A組分子量主要為20KD-50KD，B組分子量主要為3KD-20KD，C組分子量小于3KD。
　　結(jié)論：提取的蛋白經(jīng)SephadexG-50凝膠層析分離純化后主要得到三組蛤蚧蛋白組分，分

3、子量分別為20KD-50KD、3KD-20KD和小于3KD，其中以B組含量最高。
　　第二部分蛤蚧蛋白組分對肝癌HepG-2細(xì)胞和白血病K562細(xì)胞生長抑制作用
　　目的：體外觀察三組蛤蚧蛋白組分對肝癌HepG-2細(xì)胞和白血病K562細(xì)胞的生長抑制作用，篩選出作用最強的蛤蚧蛋白組分。
　　方法：采用MTS法檢測三組蛤蚧蛋白組分不同濃度下作用48h后對肝癌HepG-2細(xì)胞和白血病K562細(xì)胞的生長抑制作用，篩選出對細(xì)胞生

4、長抑制作用最強的一組蛤蚧蛋白組分，進(jìn)一步用MTS法檢測其作用72h后對肝癌HepG-2細(xì)胞和白血病K562細(xì)胞的生長抑制作用，生物倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察其作用48h后對HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞形態(tài)的影響，計算細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：三組蛤蚧蛋白組分都具有不同程度的抑制HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞生長的作用，濃度越高，抑制作用越強。其中分子量為3KD-20KD的蛤蚧蛋白組分對HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞的抑制作用最

5、強，與對照組相比，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。3KD-20KD蛤蚧蛋白組分作用48h后HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，作用48h后細(xì)胞凋亡率高于對照組，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：三組蛤蚧蛋白組分對HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞都具有不同程度的生長抑制的作用，其中3KD-20KD的蛤蚧蛋白組分的抑制作用最強，具有劑量依賴性，可通過誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞凋亡壞死發(fā)揮對細(xì)胞的生長抑制作用。<

6、br>　　第三部分3KD-20KD的蛤蚧蛋白組分抗腫瘤分子機制的研究
　　目的：體外研究3KD-20KD蛤蚧蛋白組分作用于肝癌HepG-2細(xì)胞和白血病K562細(xì)胞48h后對c-myc、p53、bax及bcl-2基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：3KD-20KD蛤蚧蛋白組分作用48h的HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞為實驗組，無蛤蚧蛋白作用的HepG-2細(xì)胞和K562細(xì)胞為對照組。采用RT-PCR方法檢測對照組和實驗組中

7、bax、bcl-2、cmyc、p53四個基因mRNA表達(dá)情況，篩選出mRNA表達(dá)有差異的基因，進(jìn)一步用免疫組化法檢測3KD-20KD蛤蚧蛋白組分對其蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)3KD-20KD蛤蚧蛋白組分作用48h后，HepG-2細(xì)胞中bax基因mRNA表達(dá)增高，K562細(xì)胞中bax基因mRNA表達(dá)增高，bcl-2基因mRNA表達(dá)降低，與對照組相比，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。在HepG-2細(xì)胞

8、和K562細(xì)胞中，實驗組的c-myc基因和p53基因mRNA表達(dá)較對照組變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)免疫組化結(jié)果顯示3KD-20KD蛤蚧蛋白組分作用48h后，HepG-2細(xì)胞中bax蛋白表達(dá)增高，K562細(xì)胞中bax蛋白表達(dá)增高，bcl-2蛋白表達(dá)降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：3KD-20KD蛤蚧蛋白組分可通過調(diào)高bax基因mRNA及蛋白表達(dá)水平誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡壞死，通過調(diào)高bax基因