光帽鱗傘抗腫瘤蛋白分離純化與表達(dá)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目前惡性腫瘤是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，但是現(xiàn)有的放療和化療藥物因療效有限、毒副作用和耐藥性等問(wèn)題在臨床應(yīng)用上受到限制，因此探索新的高效低毒的天然抗腫瘤藥物具有重要的研究意義和良好的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)SP陽(yáng)離子交換層析和Superdex凝膠過(guò)濾層析，從光帽鱗傘中分離純化得到一種新的抗腫瘤蛋白PNAP。SDS-PAGE與超速離心測(cè)定該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為18.5KDa，Edman降解法測(cè)得其N-端10個(gè)氨基酸序列為AGRTFIGY

2、NG。生物活性測(cè)定顯示PNAP對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7與宮頸癌細(xì)胞HeLa具有抗增殖作用，IC50分別為9.97μM和12.11μM。在研究PNAP是否具有HIV-1整合酶抑制活性的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PNAP具有脫氧核糖核酸酶活性，能夠作用于雙鏈與單鏈DNA，但對(duì)雙鏈DNA的作用更明顯，其最適pH為5.0，最適溫度為60℃。
　　在PNAP抗腫瘤作用機(jī)制的研究中，首先以MCF7細(xì)胞為模型檢測(cè)PNAP抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，發(fā)現(xiàn)PNAP作用于腫瘤

3、細(xì)胞MCF7后可引起典型的形態(tài)學(xué)變化如染色體固縮和線粒體膜電位降低等，還可引起細(xì)胞周期阻滯，Sub-G1期細(xì)胞比例增多，揭示PNAP抑制腫瘤細(xì)胞增殖可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。通過(guò)Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PNAP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起了細(xì)胞色素c的釋放、caspase-9和caspase-3的激活，表明PNAP可以通過(guò)內(nèi)部線粒體信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí)發(fā)現(xiàn)Fas和caspase-8的表達(dá)水平得到了提高

4、，表明PNAP也可以通過(guò)體外死亡受體信號(hào)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;另外PNAP作用于MCF7細(xì)胞還可引起B(yǎng)cl-2家族蛋白的變化。
　　接著以乳腺癌移植瘤BALB/c小鼠為模型檢測(cè)PNAP體內(nèi)抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)PNAP對(duì)小鼠乳腺癌具有抑制作用。胰酶消化乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞后，以107/ml細(xì)胞濃度皮下注射小鼠，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-200mm3時(shí)，小鼠連續(xù)給藥14天后處死，腫瘤抑制率為46.09％，說(shuō)明PNAP在體內(nèi)具有抗乳腺癌作用，

5、對(duì)體內(nèi)腫瘤組織有顯著抑制作用。HE染色分析腫瘤組織病理切片，發(fā)現(xiàn)PNAP能夠引起小鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。另外，PNAP具備免疫調(diào)節(jié)能力，PNAP給藥后，與PBS對(duì)照組相比，腫瘤小鼠脾細(xì)胞中的免疫調(diào)節(jié)因子IL-2和IFN-γ的mRNA含量明顯的提高，IL-4、IL-10和TNF-α的mRNA含量降低，而對(duì)于IL-6則無(wú)顯著作用。腫瘤小鼠經(jīng)PNAP處理后小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)因子Th1/Th2平衡向Th1偏移，使得小鼠免疫系統(tǒng)得到一定的恢復(fù)，機(jī)

6、體處于抗腫瘤狀態(tài)。同時(shí)，PNAP還具有抗氧化活性，能夠有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和清除羥基自由基與DPPH自由基，對(duì)癌癥的預(yù)防與治療能夠起到積極的作用。
　　最后，為了使PNAP能夠廣泛應(yīng)用，對(duì)PNAP蛋白進(jìn)行了重組表達(dá)。首先通過(guò)RT-PCR的方法獲得PNAP基因，然后將其克隆到表達(dá)載體pET-MBP中，繼而在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。融合蛋白經(jīng)麥芽糖親和色譜純化后，TEV酶切去除MBP標(biāo)簽蛋白，最后通過(guò)Superdex凝膠過(guò)濾層析獲得重組PN

7、AP。生物活性分析表明，重組PNAP具有一定的抗腫瘤活性，但其活性比天然PNAP低。對(duì)融合蛋白MBP-PNAP在大腸桿菌中的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳條件為:培養(yǎng)溫度30℃，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期(OD600=0.8)加入0.3 mM IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)6h，融合蛋白的表達(dá)量可達(dá)16.3mg/L，解決了天然PNAP含量低及分離純化困難等問(wèn)題，為其廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究首先從光帽鱗傘中分離純化得到一個(gè)新的抗腫瘤蛋白PNA

8、P，發(fā)現(xiàn)PNAP抑制腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，線粒體信號(hào)通路和死亡受體信號(hào)通路都參與了PNAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;PNAP在體內(nèi)同樣具有抗乳腺癌的作用，可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞凋亡;PNAP具備免疫調(diào)節(jié)能力，PNAP處理荷瘤小鼠后促使Th1/Th2平衡向Th1方向漂移，使機(jī)體處于抗腫瘤狀態(tài);同時(shí)，PNAP具有抗氧化能力，對(duì)腫瘤的預(yù)防與治療具有積極作用。PNAP作用機(jī)制的研究將為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。接著通過(guò)在大腸桿菌中重組表達(dá)PN