蟛蜞菊抗腫瘤有效部位的分離及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、中藥蟛蜞菊為菊科（Compositae）蟛蜞菊屬（Wedelia）植物蟛蜞菊（W.chinensis）的干燥全草，在我國(guó)南方民間應(yīng)用廣泛。盡管研究表明蟛蜞菊具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽和消腫止痛等多種藥理活性，然而，對(duì)蟛蜞菊的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。本文采取傳統(tǒng)的化學(xué)提取分離與體外MTT 活性篩選相結(jié)合的方法，篩選并確定蟛蜞菊抗腫瘤的有效部位，進(jìn)而研究有效部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的作用，最后通過(guò)RNA 干

2、擾、Real-time PCR和RT-PCR等方法研究有效部位抗腫瘤的分子機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 本文對(duì)蟛蜞菊進(jìn)行提取和分離，明確其抗腫瘤的有效部位，并對(duì)有效部位抗腫瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討，為蟛蜞菊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.采用傳統(tǒng)的中藥水提及醇提方法，分別以水、70％乙醇和95％乙醇作為提取溶劑對(duì)干燥的蟛蜞菊全草進(jìn)行提取，最終得到蟛蜞菊水提物浸膏、蟛蜞菊70％

3、乙醇提取浸膏和蟛蜞菊95％乙醇提取浸膏。
　　 2.采用經(jīng)典的MTT 實(shí)驗(yàn)，分別用蟛蜞菊水提物浸膏、蟛蜞菊70％乙醇提取浸膏和蟛蜞菊95％乙醇提取浸膏作用人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、人卵巢癌細(xì)胞HO-8910、人肝癌細(xì)胞Bel-7402、人肺癌細(xì)胞A549及人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375，篩選出抗腫瘤作用最明顯的提取物浸膏和對(duì)其作用最敏感的腫瘤細(xì)胞。
　　 3.兩相溶液萃取法對(duì)提取物浸膏進(jìn)行萃取，分別得石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取

4、相和正丁醇萃取相，結(jié)合MTT 實(shí)驗(yàn)篩選出抗腫瘤作用最強(qiáng)的萃取相，即為蟛蜞菊抗腫瘤初級(jí)有效部位。
　　 4.對(duì)初級(jí)有效部位進(jìn)行硅膠色譜柱層析，選用氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合薄層層析檢測(cè)合并洗脫溶液，獲得各次級(jí)部位，采用MTT 法檢測(cè)各次級(jí)部位抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，最終獲得蟛蜞菊抗腫瘤的有效部位。
　　 5. 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蟛蜞菊有效部位對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。
　　 6. Hoechst 染

5、色后熒光顯微鏡觀察蟛蜞菊有效部位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　 7. 采用RNA 干擾的方法抑制Chk1和Chk2基因的表達(dá)，通過(guò)Real-time PCR和RT-PCR 以GADpH基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)抑制效果進(jìn)行檢測(cè)，確定si-Chk1和si-Chk2能分別有效抑制Chk1和Chk2基因的表達(dá)。
　　 8. 采用MTT 法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)抑制Chk1和Chk2基因表達(dá)后，蟛蜞菊有效部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)細(xì)胞周期的影

6、響。
　　 9. RT-PCR 檢測(cè)抑制Chk1和Chk2基因表達(dá)后，蟛蜞菊有效部位對(duì)c-myc、cyclin B1和cyclin D1基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用經(jīng)典的MTT 法系統(tǒng)地研究了蟛蜞菊醇提物和水提物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明二者對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用；同時(shí)，蟛蜞菊70％醇提物比水提物及95％醇提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。進(jìn)一步MTT 結(jié)果顯

7、示，蟛蜞菊70％乙醇提取物對(duì)CNE-1細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.27±0.19 mg/ml。因此，蟛蜞菊70％乙醇提取物是抗腫瘤作用最強(qiáng)的提取物，人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1是對(duì)其作用最敏感的腫瘤細(xì)胞。
　　 2.通過(guò)兩相溶液萃取法對(duì)蟛蜞菊70％乙醇提取物進(jìn)行萃取后得到石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，經(jīng)MTT 法篩選后發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取相比其他各萃取相具有更顯著的細(xì)胞增殖抑制作用, 其半數(shù)抑制濃

8、度（IC50）為542.68±47.09 μg/ml，明顯低于其他萃取相。因此，蟛蜞菊70％乙醇提取物乙酸乙酯萃取相為體外抗腫瘤的初級(jí)有效部位。
　　 3.對(duì)乙酸乙酯萃取相進(jìn)行硅膠色譜柱層析后共得到6個(gè)次級(jí)部位（EA1、EA2、EA3、EA4、EA5和EA6）。通過(guò)MTT 法檢測(cè)EA1-6對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100％甲醇洗脫部位EA6對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，其半數(shù)抑制濃度（IC50）較其他洗脫部位

9、明顯降低，僅為96.59±19.37 μg/ml，且呈現(xiàn)出良好的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。據(jù)此，確定EA6為蟛蜞菊抗腫瘤的有效部位。
　　 4.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst 染色法檢測(cè)EA6對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，EA6作用24 h后可引起CNE-1細(xì)胞大量阻滯在G2/M 期，G2/M期細(xì)胞數(shù)從對(duì)照組的（17.14±0.85）％上升至（44.83±6.43）％；EA6作用48 h后G2/M 期細(xì)胞數(shù)從（18.

10、96±3.78）％上升至（39.57±1.58）％；EA6作用48 h后可誘導(dǎo)部分CNE-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，凋亡率由對(duì)照組的（0.6±0.1）％上升至（12.3±2.51）％。
　　 5.EA6 可誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M 期阻滯，通過(guò)RNA 干擾的方法抑制Chk1的表達(dá)后，EA6 誘導(dǎo)的細(xì)胞G2/M 期阻滯的現(xiàn)象也隨之消失，G2/M 期細(xì)胞數(shù)從（34.79±3.80）％下降至（15.45±1.63）％。但抑制Ch

11、k2的表達(dá)并不影響EA6 誘導(dǎo)的細(xì)胞G2/M 期阻滯；另外抑制Chk1的表達(dá)后，EA6不再抑制CNE-1細(xì)胞的增殖。結(jié)果還顯示，EA6作用CNE-1細(xì)胞后c-myc的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對(duì)照組，而抑制Chk1的表達(dá)后可使c-myc的表達(dá)恢復(fù)至與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃健?br>　　 結(jié)論：
　　 本研究通過(guò)對(duì)蟛蜞菊進(jìn)行逐級(jí)的分離與MTT 實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，確定100％甲醇洗脫部位為蟛蜞菊抗腫瘤的有效部位（EA6）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，EA6