茶EGCG的分離提取及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、本研究從綠茶中分離提取EGCG，并進(jìn)行在體和離體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，考察茶EGCG在體內(nèi)外的抗腫瘤作用，尋找與EGCG抗腫瘤相關(guān)的特異蛋白，分析特異蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)EGCG的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行探討。 茶EGCG采用咖啡堿沉淀溶劑萃取法分離提取，對(duì)EGCG分離提取參數(shù)采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，以EGCG的純度為考察值，選取影響EGCG分離提取的水浸提溫度、咖啡堿濃度以及氯仿、己酸乙酯和乙酸丙酯的萃取次數(shù)為自變量，建立數(shù)學(xué)模型，

2、篩選最優(yōu)分離提取條件。再選用癌細(xì)胞(小鼠肉瘤細(xì)胞株S180和人肝癌細(xì)胞株HUH-7)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，進(jìn)行離體抗癌實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞株按不同濃度梯度用EGCG進(jìn)行處理，采用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的抑制率，考察EGCG在體外對(duì)癌細(xì)胞的作用。隨后建立小鼠荷瘤模型(小鼠肉瘤S180和小鼠宮頸癌U14腫瘤模型)，與陽(yáng)性組(環(huán)磷酰胺組)和空白組對(duì)照考察EGCG的抗腫瘤效果。并對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理組織學(xué)分析，與對(duì)照組比較，觀察EGCG抗癌作用。還進(jìn)行了腫瘤組織

3、的總蛋白質(zhì)抽提，對(duì)蛋白質(zhì)采用雙向電泳(2-DE)、質(zhì)譜(MS)鑒定和生物信息學(xué)方法進(jìn)行研究。 咖啡堿沉淀溶劑萃取法是一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉的實(shí)驗(yàn)室提取EGCG的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取最優(yōu)參數(shù)組合為水浸提溫度、咖啡堿濃度以及氯仿、己酸乙酯和乙酸丙酯的萃取次數(shù)分別為：80℃、30mmol/L、5、3和3，在此條件下從高EGCG綠茶中分離提取EGCG，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化得到的EGCG成品經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，純度為98.7％。離體實(shí)驗(yàn)證明

4、EGCG對(duì)人肝癌HUH-7細(xì)胞以及小鼠肉瘤S180細(xì)胞生長(zhǎng)的均有明顯抑制作用，最高抑制率(EGCG濃度為100μg/mL時(shí))分別為54.8896和63.52％，都表現(xiàn)為濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)觀察到EGCG對(duì)小鼠肉瘤S180細(xì)胞和對(duì)人肝癌HUH7細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差別。在體實(shí)驗(yàn)EGCG(60mg/kg.d×10d)對(duì)小鼠肉瘤S180和小鼠宮頸癌U14的抑制率為51.19％和45.78％，陽(yáng)性組(環(huán)磷酰胺組)的抑制率分別為64.

5、49％和58.4296，EGCG和環(huán)磷酰胺對(duì)這兩種腫瘤的作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差別。離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)都證明EGCG具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，可以作為抗腫瘤藥加以開(kāi)發(fā)。 與空白組對(duì)照，雙向電泳(2-DE)在S180組有21個(gè)差異蛋白點(diǎn)(表達(dá)下調(diào)16個(gè)，上調(diào)5個(gè))，在U14組有20個(gè)差異蛋白點(diǎn)(表達(dá)下調(diào)13個(gè)，上調(diào)7個(gè))。篩選其中差異最顯著的10個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)鑒定、串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS

6、)分析與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定出其中8個(gè)蛋白質(zhì)，分別是是：transferrin、parvalbumin、stress-induced phosphoprotein、Alpha-enolase、Heat shock 27kDa protein，Annexin A2、crystallin、ribosomal protein，還有兩個(gè)未知蛋白質(zhì)。認(rèn)為EGCG抗腫瘤作用是通過(guò)與特異的蛋白質(zhì)相結(jié)合，直接或間接地和靶蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)，An