蠐螬多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)特征與抗腫瘤作用的研究.pdf

1、目的：
　　蠐螬是金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子及同屬近緣昆蟲的干燥幼蟲，作為藥用，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。研究表明：蠐螬具有抗腫瘤、抗菌、抗凝血、抗炎、抗病毒等多種作用。由于動物來源的多糖含有的單糖殘基較植物多糖種類多，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，近年來，在抗腫瘤藥物的研發(fā)中受到關(guān)注。但至今鮮有蠐螬多糖制備、結(jié)構(gòu)和活性的研究報道。本課題擬通過蠐螬多糖的提取分離工藝，均一性多糖的純化，理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)研究，各均一性多糖抑制黑色素瘤增殖作用的比較及作用

2、機制的初步探討，以期為揭示蠐螬抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)；豐富多糖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，研發(fā)抗腫瘤新藥奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1．首次建立了蠐螬多糖的提取分離、脫色素的方法，制備得到了蠐螬總多糖。采用過氧化氫法去除了蠐螬多糖的色素；采用離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法對蠐螬多糖進行分離純化，得到4種均一性多糖。
　　2．用高效尺寸排阻色譜法、苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法、咔唑法、硫酸鋇比濁法、半胱氨酸-硫酸法、紫外分光光度法等分析方法

3、對蠐螬多糖的均一性及分子量、總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸、硫酸基、氨基含量等理化性質(zhì)進行了測定，采用蠐螬多糖全水解、甲基化等化學(xué)方法和IR、GC、GC-MS、NMR（1H,13C,1H-1HCOSY, HSQC,HMBC, NOESY和TOCSY）等儀器方法對4種蠐螬多糖（HDPS-1Ⅱ、HDPS-2Ⅱ、HDPS-3Ⅱ和HDPS-4Ⅱ）的一級結(jié)構(gòu)進行研究。
　　3．荷瘤小鼠抑瘤實驗測定了4種蠐螬均一性多糖和總多糖對黑色素瘤B16的抑制作用

4、；HE染色觀察小鼠腫瘤組織；免疫組化法測定移植瘤血管密度。
　　4．MTT法測定了4種蠐螬均一性多糖和總多糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的抑制作用；體外微管的形成實驗比較了各多糖對HUVECs微管形成的影響；Western blot法測定了多糖對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、P-VEGF和半乳凝素1（Gal-1）蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1．從蠐螬多糖中分離純化，得到5種多糖，分別命名為HDPS-1Ⅱ、H

5、DPS-2Ⅰ、HDPS-2Ⅱ、HDPS-3Ⅱ和HDPS-4Ⅱ，其中四種含量較高。用反復(fù)凍融法和過氧化氫法分別去除蠐螬多糖中的蛋白質(zhì)和色素。
　　2．HDPS-1Ⅱ、HDPS-2Ⅱ、HDPS-3Ⅱ和 HDPS-4Ⅱ在 HPSEC譜中，呈現(xiàn)單一對稱峰，表明其為均一性多糖；重均分子量分別為3.8×105、8.2×103、1.7×104和1.9×104 Da。硫酸鋇比濁法和半胱氨酸-硫酸法測定發(fā)現(xiàn)各蠐螬多糖均含有硫酸基和氨基；結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)

6、，4種多糖的單糖組成為Rha，Xyl，Glc和Gal，它們的摩爾比依次為1.00∶1.75∶4.64∶6.22，1.00∶3.30∶12.1∶12.7，1.00∶1.76∶2.96∶1.53和3.71∶1.00∶1.38∶3.30。HDPS-1Ⅱ的糖鏈主要由1,4-Rhap、1,2-Rhap、1,2,3-Rhap、1,2,4-Rhap、1,4-Glcp、1,6-Galp、T-Galp、1,2,4-Glcp、1,2,4-Xylp、T-Gl

7、cp、T-Rhap、1,4-Galp、1,3,4-Glcp和1,3,4-Galp組成，其摩爾比分別為4.03∶2.54∶1.00∶11.0∶2.82∶44.7∶3.61∶8.92∶2.51∶27.6∶5.03∶4.15∶2.92∶3.69；HDPS-2Ⅱ的糖鏈主要是由1,4-Rhap、1,2-Rhap、1,2,4-Rhap、1,4-Glcp、1,6-Galp、1,2,4-Glcp、1,2,4-Xylp、T-Glcp、T-Rhap、1,4

8、-Galp、1,3,4-Glcp和1,3,4-Galp組成，其摩爾比分別為2.74∶1.60∶2.15∶1.00∶33.40∶3.30∶2.04∶21.12∶3.16∶2.31∶1.33∶2.08；HDPS-3Ⅱ的糖鏈主要是由1,4-Rhap、1,2,4-Rhap、1,6-Galp、1,2,4-Glcp、1,2,4-Xylp、T-Glcp、T-Rhap、1,4-Galp、1,3,4-Glcp和1,3,4-Galp組成，其摩爾比為2.64

9、∶2.62∶8.20∶4.73∶1.00∶27.33∶3.73∶1.88∶1.24∶2.20；HDPS-4Ⅱ的糖鏈主要是由1,4-Rhap、1,2-Rhap、1,2,4-Rhap、1,6-Galp、1,2,4-Glcp、1,2,4-Xylp、T-Glcp、T-Rhap、1,4-Galp、1,3,4-Glcp和1,3,4-Galp組成，其摩爾比分別為7.47∶1.69∶6.66∶35.50∶17.45∶3.12∶23.20∶7.64∶3.

10、98∶2.06∶3.13。
　　3．4種蠐螬均一性多糖的體內(nèi)抗腫瘤活性差異明顯，其中HDPS-2Ⅱ和HDPS-3Ⅱ?qū)δ[瘤細胞的抑制率較高；HE染色顯示，HDPS-2Ⅱ和HDPS-3Ⅱ的腫瘤組織出現(xiàn)大面積的壞死；各蠐螬多糖對腫瘤微血管產(chǎn)生的抑制程度不同，其中 HDPS-2Ⅱ和HDPS-3Ⅱ的抑制作用明顯。
　　4．在100和300μg/mL的HDPS-2Ⅱ和HDPS-3Ⅱ?qū)UVECs細胞增殖有較弱的抑制；4種均一性多糖和總多

11、糖可不同程度的抑制 HUVECs微管樣結(jié)構(gòu)的形成，其中HDPS-2II和HDPS-3II組形成的管腔狀結(jié)構(gòu)明顯減少；100μg/mL的HDPS-2II和HDPS-3II處理細胞24 h后，細胞中P-VEGFR2和Gal-1的表達明顯降低；同時，細胞中VEGFR2蛋白的表達明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1．建立了蠐螬的堿水提取，反復(fù)凍融法除蛋白，氧化法脫色素的總多糖制備方法；蠐螬總多糖分離純化得到5種多糖，其中4種含量較高。