中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis)抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究.pdf

1、中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker），俗稱土鱉、土元等，屬于蜚蠊目(Blattodea)，鱉蠊科（Corydiidae），地鱉亞科(Polyphaginae)，真地鱉屬(Eupolyphaga)昆蟲，目前已實現(xiàn)大規(guī)模人工養(yǎng)殖。中華真地鱉作為一種傳統(tǒng)中藥，在我國具有悠久的藥用歷史?，F(xiàn)代研究表明，中華真地鱉具有溶解血栓、抗凝血、抗腫瘤、促進(jìn)骨折愈合、調(diào)節(jié)血脂等十分廣泛的藥理作用。對于中華真地鱉的研究，國外學(xué)者

2、很少涉及，其研究近乎空白。近年來，國內(nèi)學(xué)者研究表明中華真地鱉蛋白提取物能夠抑制血管生成和腫瘤生長。可見，蛋白組分被認(rèn)為是中華真地鱉的抗腫瘤有效組分。但是，到目前為止，尚未見中華真地鱉抗腫瘤蛋白成分的報導(dǎo)。
　　我們利用現(xiàn)代生化分離技術(shù)，從中華真地鱉新鮮雌蟲體中分離純化得到一分子質(zhì)量約為72 kDa的抗腫瘤蛋白，命名為EPS72。該蛋白對人肝癌細(xì)胞株Bel-7402、肺癌細(xì)胞株A549等多種人癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖抑制作用。以A5

3、49細(xì)胞作為體外腫瘤模型，研究了EPS72對細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡、粘附、伸展、遷移以及侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)EPS72具有體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，并初步探討了EPS72體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移可能的分子機(jī)制。期望為EPS72進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的線索，同時為抗腫瘤蛋白類藥物的研究提供一些新的思路。本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果有以下幾個方面:
　　1中華真地鱉抗腫痛蛋白的提取、純化及鑒定。
　　首先采用硫酸銨分級沉淀（50％～80％飽和度）、超濾

4、(截留分子質(zhì)量為10 kDa)和冷凍干燥技術(shù)獲得蛋白粗提物（組分Ⅰ）。由組分Ⅰ得到抗腫瘤活性蛋白的純化方案由捕獲、中度純化和精制三個步驟組成:(1)捕獲:分別采用CM-Sepharose FF陽離子交換色譜和DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜對抗腫瘤有效活性組分進(jìn)行捕獲;(2)中度純化:分別采用Q-Sepharose HP陰離子交換色譜和Butyl Sepharose HP疏水色譜進(jìn)行中度純化;(3)精制:采用Superd

5、ex75凝膠過濾色譜進(jìn)行精制。整個純化過程中采用280 nm檢測蛋白質(zhì)洗脫情況，分別收集各洗脫峰，采用MTT法追蹤抗腫瘤活性組分，最后得到的活性組分進(jìn)行冷凍干燥即為純化所得抗腫瘤蛋白（組分Ⅵ）。每1 kg新鮮活蟲材料大約可得到電泳純的抗腫瘤蛋白56 mg，蛋白得率0.0056％。
　　活性組分Ⅵ在SDS-PAGE及Native-PAGE中均顯示為單一條帶，表觀分子質(zhì)量約為72 kDa，表明其達(dá)到了電泳純，可能為單鏈蛋白;MALDI

6、-TOF質(zhì)譜結(jié)果表明其分子質(zhì)量為71.737 kDa，與SDS-PAGE結(jié)果基本吻合，說明純化得到的抗腫瘤蛋白為單鏈蛋白，分子量約為72 kDa，故命名為EPS72。
　　2 EPS72體外抗腫瘤活性研究。
　　MTT存活分析表明EPS72對肝癌Bel-7402細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞等多種人癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖抑制作用。接著以A549細(xì)胞作為體外腫瘤模型，研究了EPS72對細(xì)胞形態(tài)、凋亡、粘附、伸展、遷移以及侵襲的影響。

7、相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究、臺盼藍(lán)染色計數(shù)、AO/EB染色以及JC-1檢測細(xì)胞膜電位（△Ψm）結(jié)果表明，EPS72作用早期可誘導(dǎo)已貼壁生長的腫瘤細(xì)胞脫粘附，但是剛脫粘附細(xì)胞為胞膜完整的活細(xì)胞，撤藥后能正常生長，而脫粘附細(xì)胞持續(xù)受藥物作用后則會進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡性死亡。可見，EPS72誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞脫粘附的作用是直接的，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用是間接的。細(xì)胞粘附實驗進(jìn)一步表明，EPS72能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白成分纖粘連蛋

8、白（fibronectin，F(xiàn)N）和Ⅳ型膠原蛋白(collagenⅣ，ColⅣ)的粘附，但對細(xì)胞向非ECM成分多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PL)的粘附卻沒有影響。癌細(xì)胞體外伸展實驗結(jié)果表明，EPS72能夠抑制腫瘤細(xì)胞在ECM表面上伸展。創(chuàng)傷愈合實驗表明EPS72能夠阻止腫瘤細(xì)胞向創(chuàng)傷面遷移。Transwell實驗進(jìn)一步證明EPS72能夠影響腫瘤細(xì)胞向Matrigel的侵襲能力?？梢姡珽PS72通過影響腫瘤細(xì)胞的粘附、伸展、轉(zhuǎn)

9、移、侵襲及增殖、存活能力發(fā)揮體外抗腫瘤作用，EPS72具有體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。
　　3 EPS72體外抗腫瘤作用的分子機(jī)制。
　　為了進(jìn)一步探討EPS72體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，利用熒光顯微鏡采用免疫熒光法研究了EPS72對細(xì)胞肌動蛋白骨架成分F-actin的影響;采用流式細(xì)胞儀和Western blotting技術(shù)研究了EPS72作用后腫瘤細(xì)胞β1-整合素和整合素關(guān)聯(lián)蛋白激酶(ILK)表達(dá)情況。結(jié)果表明，EPS72作用后

10、F-actin的聚合受到抑制，腫瘤細(xì)胞β1-整合素和ILK的表達(dá)受到抑制，推測EPS72可能通過直接靶向腫瘤細(xì)胞表面的β1-整合素，進(jìn)而影響整合素—細(xì)胞骨架信號通路發(fā)揮體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
　　本研究取得的成果和結(jié)論主要有:
　　(1)采用現(xiàn)代生化分離技術(shù)，首次從中華真地鱉新鮮雌蟲體中分離純化得到一種分子量約為72 kDa的抗腫瘤蛋白，命名為EPS72。該分離純化工藝條件溫和，操作簡單，并易于規(guī)?；糯笊a(chǎn)。
　　(2

11、)體外研究表明，EPS72對人肝癌Bel-7402細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞等人癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的胞毒活性，而對非癌細(xì)胞株MRC5的細(xì)胞毒性較低，顯示該活性蛋白具有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤活性，且對腫瘤細(xì)胞顯示出良好的選擇性。
　　(3)確定了EPS72通過影響腫瘤細(xì)胞的粘附、伸展、轉(zhuǎn)移、侵襲及增殖、存活能力發(fā)揮體外抗腫瘤作用，EPS72具有體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力。
　　(4)初步推測EPS72可能通過直接靶向腫瘤細(xì)胞表面的β1-整合素，