香鱗毛蕨素體外抗腫瘤活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和細(xì)胞凋亡息息相關(guān)，因此細(xì)胞凋亡在腫瘤化療藥物治療中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)過量的ROS(reactive oxygen species)可以導(dǎo)致膜電位下降，釋放凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí)ROS的累積還會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此對(duì)ROS相關(guān)抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為熱點(diǎn)。
　　香鱗毛蕨素(dryofragin)是從香鱗毛蕨Dryopteris fragrans(L.) S

2、chott中提取分離得到的一種間苯三酚類化合物，已知具有一定的抗腫瘤活性，但其機(jī)制至今未見報(bào)道。本文以香鱗毛蕨素為研究對(duì)象，對(duì)其體外抗腫瘤活性及分子機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)香鱗毛蕨素通過上調(diào)ROS激發(fā)線粒體凋亡途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果如下:
　　1.香鱗毛蕨素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有良好的增殖抑制作用。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明香鱗毛蕨素對(duì)多種人源腫瘤細(xì)胞均具有一定程度的生長抑制作用，其中對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的抑制作用最顯著，IC5

3、0值是27.26±0.89μM，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香鱗毛蕨素對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制呈明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)的IC50值是52.68±1.33μM，說明香鱗毛蕨素對(duì)正常細(xì)胞株的毒性較小。
　　2.香鱗毛蕨素能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。在表觀形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)吖啶橙染色的MCF-7細(xì)胞用激光共聚焦顯微鏡觀察形態(tài)變化，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，給藥后的細(xì)胞間隙明顯增加，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核碎裂成清晰可見的凋亡

4、小體。DNA片段化檢測(cè)是通過提取香鱗毛蕨素作用后的MCF-7細(xì)胞DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過20μM和30μM處理的細(xì)胞能夠觀察到明顯的DNA Ladder。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，隨著給藥濃度的增加，阻滯在G2/M期的細(xì)胞比例不斷增大，同時(shí)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率也隨之增加。
　　3.香鱗毛蕨素上調(diào)ROS激活線粒體凋亡途徑
　　(1)香鱗毛蕨素能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位。

5、DCFH-DA染色結(jié)果顯示，香鱗毛蕨素作用后細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生呈明顯的時(shí)間依賴和劑量依賴，同時(shí)，羅丹明123染色后檢測(cè)到線粒體膜電位隨著給藥時(shí)間和濃度不斷下降。采用ROS抑制劑NAC預(yù)處理腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)藥物對(duì)ROS、膜電位和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，加入NAC后香鱗毛蕨素誘導(dǎo)的ROS升高、膜電位下降和細(xì)胞凋亡受到抑制。
　　(2)香鱗毛蕨素通過上調(diào)ROS引發(fā)線粒體途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。藥物作用后，細(xì)胞內(nèi)ROS升高，線粒體膜電位降低，

6、繼而使Bcl-2對(duì)Bax的結(jié)合受到抑制，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增加，線粒體中細(xì)胞色素C表達(dá)量下降而胞漿中表達(dá)量增多，激活caspase-9和caspase-3，進(jìn)而剪切細(xì)胞核內(nèi)PARP，造成DNA不可修復(fù)的損傷，最終造成腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，香鱗毛蕨素對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，這種抑制作用與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。香鱗毛蕨素通過增加ROS的產(chǎn)生，激活線粒體凋亡途徑，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終誘導(dǎo)腫瘤