老鸛草素體外抗MCF-7細(xì)胞活性及其初步作用機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌已成為世界上女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率逐年上升，并且發(fā)病率趨于年輕化。因此，開(kāi)發(fā)治療和預(yù)防乳腺癌的方法已成為當(dāng)今相關(guān)科研工作者的研究熱點(diǎn)之一。腫瘤與一些信號(hào)通路有著非常緊密的關(guān)聯(lián)，隨著人們對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入，篩選能對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行調(diào)節(jié)的先導(dǎo)化合物已成為抗腫瘤新藥研究領(lǐng)域的任務(wù)之一。
　　老鸛草素是從植物老鸛草中提取分離獲得的多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒以及抗高血壓等多種藥

2、理活性。老鸛草素的抗腫瘤活性雖然已有報(bào)道，但對(duì)其抗腫瘤的機(jī)制并未有深入的研究。因此，本論文系統(tǒng)的研究了老鸛草素體外抑制MCF-7細(xì)胞增殖的活性及其初步分子作用機(jī)制，為老鸛草素新藥研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　1.確定了老鸛草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株具有顯著的增殖抑制效果。
　　老鸛草素對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞株有增殖抑制效果，特別是對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，IC50值為9.94±0.65μM，并且呈現(xiàn)濃

3、度和時(shí)間依賴(lài)性特征。此外，老鸛草素對(duì)正常的小鼠單核巨噬細(xì)胞Raw264.7的IC50值是65.69±0.83μM大于其它腫瘤細(xì)胞株，表明老鸛草素對(duì)正常細(xì)胞株的毒性較小。老鸛草素對(duì)MCF-7細(xì)胞24 h、48 h和72h的IC50值分別是42.32±0.23μM、17.98±0.62μM和9.94±0.38μM。同時(shí)，老鸛草素作用于MCF-7細(xì)胞后，可以觀察到其細(xì)胞染色質(zhì)凝聚到一起并且細(xì)胞數(shù)量變少，初步斷定老鸛草素可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)

4、生凋亡。
　　2.老鸛草素能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　采用羅丹明123染色法檢測(cè)老鸛草素作用于MCF-7細(xì)胞后線(xiàn)粒體跨膜電位的變化情況，結(jié)果膜電位呈現(xiàn)明顯地下降趨勢(shì);用Annexin V-FITC/PI熒光檢測(cè)法檢測(cè)老鸛草素對(duì)MCF-7細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示老鸛草素使細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻，從而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡。
　　3.老鸛草素能夠通過(guò)p38 MAPK凋亡途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋

5、亡。
　　利用Western blotting法檢測(cè)不同濃度的老鸛草素對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)用老鸛草素處理后，與空白對(duì)照相比，Cleaved PARP與Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量均隨著藥物濃度的增加而升高，說(shuō)明PARP被caspase-3剪切，使PARP不能與DNA結(jié)合，進(jìn)而不能發(fā)揮正常功能，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡。
　　(2)在老鸛革素作用下，抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量隨

6、著時(shí)間的增加而減小，磷酸化的Bcl-2蛋白含量升高，說(shuō)明老鸛草素可以負(fù)調(diào)Bcl-2蛋白，增加phosphorylationBcl-2。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中有幾種不同的激酶會(huì)參與調(diào)節(jié)磷酸化Bcl-2。為了確定哪種激酶參與了調(diào)節(jié)磷酸化Bcl-2，又對(duì)MAPK家族的幾種蛋白進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，老鸛草素能夠抑制Akt磷酸化，同時(shí)可以顯著引起p38 MAPK的磷酸化。
　　(3)為了進(jìn)一步檢測(cè)老鸛草素引起的凋亡是否與p38蛋白的激活有關(guān)，檢

7、測(cè)了p38抑制劑加入后，一些相關(guān)蛋白的變化情況。加入老鸛草素后細(xì)胞的存活率下降，然而同時(shí)加老鸛草素和p38抑制劑組，存活率明顯上升，也就是說(shuō)p38抑制劑會(huì)削弱老鸛草素對(duì)細(xì)胞的影響。加入了p38抑制劑后，老鸛草素引起磷酸化的Bcl-2、負(fù)調(diào)Bcl-2以及引起cleaved-PARP表達(dá)這些現(xiàn)象都有所減弱。表明老鸛草素引起細(xì)胞凋亡是與p38緊密相關(guān)的。
　　(4)為了檢測(cè)老鸛草素引起的凋亡是否與ROS是否有關(guān)，檢測(cè)了NAC處理后，RO

8、S以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示ROS參與乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。利用DCFH-DA熒光染色法和Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)老鸛草素對(duì)細(xì)胞中ROS的變化影響和ROS對(duì)老鸛草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，老鸛草素能夠升高M(jìn)CF-7細(xì)胞中ROS的含量，但加入ROS抑制劑NAC后，能夠抑制老鸛草素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡。
　　綜上所述，老鸛草素可以抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，這種抑制作用與藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡緊密相