胡桃醌抗腫瘤作用及其機制研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的重要疾病之一，是新世紀人類第一殺手，對人類生存構(gòu)成最嚴重的威脅。目前較為成熟的治療方法有手術(shù)治療、放射治療、藥物治療及免疫治療四類。近幾年來，腫瘤化療取得了很大的進步，但對危害人類生命健康最嚴重的、占惡性腫瘤90%以上的實體瘤的治療效果不盡人意；并且絕大多數(shù)抗腫瘤藥物在抑制或殺傷腫瘤細胞的同時，對正常組織、器官不可避免地產(chǎn)生損害或毒性作用，給患者帶來痛苦，甚至導(dǎo)致死亡。因此，開發(fā)與研究新型有效的抗腫瘤藥物是生

2、物醫(yī)藥科研領(lǐng)域的重大課題和長期任務(wù)。 我國的藥用植物物種資源豐富，含抗癌活性成分的物種有200種左右，迄今已通過腫瘤細胞株及動物移植性腫瘤篩選的植物單體成分已超過4000余種。植物來源藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機制方面均具有多樣性；同時，長期以來中醫(yī)治療腫瘤的研究已積累豐富的資料和經(jīng)驗，有助于開發(fā)和研制植物來源的抗腫瘤新藥。因此，從天然藥物中獲取有效成分并以此為先導(dǎo)化合物是抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的重要途徑之一。 胡桃醌（Jugl

3、one；Nucin）又名5-羥基-1，4-萘醌；5-羥基-1，4-萘二酮。是從胡桃楸新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物，是胡桃楸中主要的毒性物質(zhì)。在中國胡桃楸皮作為民間抗癌驗方，歷史悠久，作為胡桃楸的主要成分胡桃醌的抗癌活性研究也有報道。近年來有研究顯示其具有抗真菌、抗衣原體或抗HIV病毒、抗癌、降血糖和殺蟲等生物活性，越來越受到人們的重視。因此，進一步開發(fā)胡桃醌抗腫瘤活性，了解其作用機制，有著非常重要的現(xiàn)實意義。

4、 目的： 篩選敏感細胞株，探討胡桃醌抗腫瘤作用的細胞學(xué)機制；在體實驗考察胡桃醌抗腫瘤活性，并對其毒性進行評價；研究胡桃醌對腫瘤轉(zhuǎn)移形成的影響；檢測胡桃醌SD大鼠血漿蛋白結(jié)合率，為其機體代謝提供一定理論基礎(chǔ)。 方法： 1.采用MTT法測定胡桃醌對不同細胞株的生長抑制率，篩選敏感細胞株。 2.采用Flou-3/AM法檢測胡桃醌對BEL-7402細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響，通過流式細胞儀觀察12.5μmol/

5、L胡桃醌作用后細胞線粒體膜電勢的變化、細胞周期分布及凋亡細胞比率，采用熒光偏振技術(shù)離體動態(tài)地檢測30min內(nèi)胡桃醌對BEL-7402細胞各向異性r、熒光偏振度mP和微粘度η的影響，分析細胞膜流動性的改變。 3.12.5μmol/L胡桃醌作用于BEL-7402細胞24h后固定，分別行HE染色、考馬斯亮藍染色和掃描電鏡及透射電鏡的樣品制備。 4.200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L和12

6、.5μmol/L胡桃醌作用于EAHY926細胞株24h后MTT法檢測細胞存活率，選用劃痕法探討胡桃醌對內(nèi)皮細胞遷移的影響。采用大鼠主動脈無血清培養(yǎng)法，加入100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L和12.5μmol/L濃度的胡桃醌，觀察其對血管內(nèi)皮細胞爬行及其微血管結(jié)構(gòu)形成的影響；選用7日齡雞胚進行雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗，探討胡桃醌對新生血管形成的影響。 5.采用人肝癌BEL-7402細胞裸鼠皮下移植瘤模型，通過

7、腹腔注射和局部注射兩個給藥途徑進行胡桃醌藥效學(xué)的研究。 6.采用小鼠B16/F10黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型研究4.5mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg和0.75mg/kg胡桃醌對腫瘤細胞血道轉(zhuǎn)移的作用。 7.采用超濾法，通過高效液相（HPLC）考察胡桃醌的血漿蛋白結(jié)合率。 結(jié)果： 1.不同類型的細胞株對胡桃醌的敏感性不同：人肝癌HepG2細胞株IC50為10.93841μmol/L，人肝癌BEL-7

8、402細胞株IC50為14.66485μmol/L，人乳腺癌MCF-7細胞株IC50為20.788μmol/L，人肺癌A549細胞株IC50為24.41432μmol/L，人鼻咽癌CNE2細胞株IC50為25.3178μmol/L，人宮頸癌HeLa細胞株IC50為27.90769μmol/L，。 2.100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L胡桃醌均可抑制人肝癌BEL-74

9、02細胞的生長，誘導(dǎo)其凋亡，IC50為13.78μmol/L。25μmol/L、12.5μmol/L胡桃醌作用BEL-7402細胞株24h后行PI染色，結(jié)果顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)；同時存在明顯的細胞碎片峰。而胡桃醌作用HepG2細胞株24h后行PI染色，結(jié)果顯示只有明顯的細胞碎片峰，而無凋亡峰出現(xiàn)。胡桃醌作用于BEL-7402細胞4h后線粒體膜電勢降低，提示BEL-7402細胞已經(jīng)開始凋亡級聯(lián)反應(yīng)。400μmol/L、200μmol/L

10、、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L胡桃醌均可引起B(yǎng)EL-7402細胞膜的r、mP和η值顯著性降低（P<0.05），尤其在最初1min內(nèi)r、mP、η值下降迅速，1min后各指標下降的趨勢漸漸平緩。不同濃度的胡桃醌作用BEL-7402細胞30min后未見胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生改變，結(jié)果提示胡桃醌可能通過Capase途徑誘導(dǎo)細胞調(diào)亡。 3.12.5μmol/L胡桃醌作用B

11、EL-7402細胞24h后細胞形態(tài)和細胞骨架均發(fā)生改變。掃描電鏡結(jié)果顯示BEL-7402細胞胞體體積縮小，與周圍細胞群脫離，表面微絨毛卷曲、畸變、小球結(jié)構(gòu)逐漸增多，細胞間連接逐漸斷裂，細胞間隙增寬，有凋亡小體形成。透射電鏡結(jié)果顯示，細胞微絨毛消失，膜完整，胞核濃集，異染色質(zhì)增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體疏散、輕度腫脹，嵴消失。 4.200μmol/L、100μmol/L和50μmol/L濃度胡桃醌對EAHY926有明顯的抑制作用（P<

12、0.05），IC50為122.848μmol/L；25μmol/L、12.5μmol/L和6.25μmol/L的胡桃醌促進EAHY926細胞株的生長（P<0.05）。100μmol/L、50μmol/L和25μmol/L的胡桃醌均可抑制大鼠主動脈微血管形成（P<0.01），12.5μmol/L的胡桃醌可明顯減少內(nèi)皮細胞的爬行數(shù)量，延緩其爬行速度（P<0.01）。200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L及25μmol/L胡

13、桃醌作用于雞胚絨毛尿囊膜，其血管呈現(xiàn)現(xiàn)不同程度的充血、出血，甚至凝血，呈劑量依賴性；各組胡桃醌作用區(qū)域均無新生血管形成。 5.以600μg/kg、300μg/kg和150μg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402細胞裸鼠皮下移植瘤模型，NK細胞活性檢測發(fā)現(xiàn)，600μg/kg、300μg/kg胡桃醌組裸鼠NK細胞活性較正常對照組低（P均<0.01），150μg/kg胡桃醌組的NK細胞活性與正常對照組無顯著差異（P>0.05）

14、；但600μg/kg胡桃醌組NK細胞活性與陽性對照組（5-Fu）相似（P>0.05）。結(jié)果提示胡桃醌對小鼠免疫系統(tǒng)有一定的損傷作用。但600μg/kg、300μg/kg和150μg/kg胡桃醌對腫瘤生長沒有明顯的影響（P均>0.05）。 不同PH（PH=7.4、PH=4.0）600μg/kg、300μg/kg和150μg/kg胡桃醌對人肝癌BEL-7402細胞裸鼠皮下移植瘤模型局部給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同PH值的600μg/kg、30

15、0μg/kg胡桃醌局部注射抑瘤作用與空白對照組相比存在顯著差異（P均<0.05），而與陽性對照組（5-Fu）組相比無顯著差異（P>0.05）；同一濃度不同PH胡桃醌間的抑瘤作用無顯著差異（P>0.05）。 以4.5mg/kg、3mg/kg和1.5mg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402細胞裸鼠皮下移植瘤模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4.5mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg胡桃醌的腫瘤抑制率分別為78.24%、66.57%、48.

16、94%；4.5mg/kg、3mg/kg胡桃醌的抑瘤作用可與陽性對照組相當(dāng)（P均>0.05）。但4.5mg/kg胡桃醌組裸鼠出現(xiàn)明顯的皮下脂肪減少、消瘦，并有死亡現(xiàn)象。 6.4.5mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg和0.75mgkg胡桃醌對小鼠黑色素瘤B16F10血道轉(zhuǎn)移抑制率分別為27.30%、55.35%、31.52%和25.34%；3mg/kg胡桃醌抑瘤率與陽性對照組相當(dāng)（P>0.05）。而4.5mg/kg胡桃醌抑制

17、率低可能是由于該劑量胡桃醌降低機體免疫功能造成的。 7.胡桃醌SD大鼠血漿蛋白結(jié)合率為90.92%。 結(jié)論： 1.胡桃醌能有效抑制人源腫瘤細胞增殖；但細胞株類型不同，其敏感性不同。 2.胡桃醌能有效改變?nèi)烁伟〣EL-7402細胞亞顯微結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細胞死亡。 3.胡桃醌能顯著增加BEL-7402細胞的膜流動性，促進藥物進入細胞內(nèi)部，提高藥物對細胞的毒性。 4.胡桃醌具有抗血管生成作用。