牛蒡苷元的制備及其抗腫瘤作用機(jī)制.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的的主要疾病之一，全球平均每8個(gè)死亡病例中就有1人死于癌癥。目前，大多數(shù)的抗腫瘤藥物雖然具有一定療效，但仍然存在著副作用大、價(jià)格昂貴等諸多劣勢。因此，尋找新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)。我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療腫瘤方面有著悠久的歷史，中草藥中含有多種具有很強(qiáng)抗腫瘤作用的植物單體，如何將其分離提取出來并進(jìn)行合理的開發(fā)利用，成為了世界醫(yī)學(xué)面臨的重要課題?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，中藥牛蒡子具有抗炎、抗病毒、

2、抗腫瘤等多種生物活性。其主要有效成分牛蒡苷(Arctiin，ARC)在人體內(nèi)生物利用度低，需經(jīng)腸道微生物酶解轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元(Arctigenin，ARG)方能吸收入血液，發(fā)揮藥效。目前，藥學(xué)研究用ARG多為實(shí)驗(yàn)室自制，其制備方法都或多或少存在著一些不足之處，如提取效率低、步驟繁雜、對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求高等。本研究采用微生物發(fā)酵法和硅膠柱層析法從牛蒡子粉中分離純化ARG，成功建立了一種簡便高效的提取方法。此外，據(jù)相關(guān)報(bào)道，ARG可以抑制多種惡

3、性腫瘤細(xì)胞的生長，但對于其抗腫瘤作用的分子機(jī)制卻知之甚少。本研究選取人肝細(xì)胞癌作為研究對象，對ARG體內(nèi)外抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了深入探討。
　　ARG的制備:本研究采用微生物發(fā)酵法，篩選出泡盛曲霉變種和里氏木霉作為發(fā)酵菌種，利用兩株霉菌所產(chǎn)生的生物酶對牛蒡子粉進(jìn)行炮制，將牛蒡子粉中的牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元。并且通過對發(fā)酵過程中碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、pH、裝液量、接種量、發(fā)酵底物固液比、碳氮比等諸多因素進(jìn)行優(yōu)化，制定出一套牛蒡子粉最佳發(fā)酵工

4、藝，可使牛蒡苷轉(zhuǎn)化率達(dá)97.8％，產(chǎn)物溶出率達(dá)95.7％，損失率低至4.3％。最后采用硅膠柱層析法純化牛蒡子發(fā)酵粗提物，牛蒡苷元純化產(chǎn)物為白色晶體，純度可達(dá)到99％以上。
　　ARG體外抗腫瘤機(jī)制研究:通過MTT比色法檢測ARG在體外對腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株的增殖抑制活性，結(jié)果表明ARG具有良好的廣譜抗癌活性，但對正常細(xì)胞卻沒有明顯的抑制作用。為進(jìn)一步研究ARG的抗腫瘤機(jī)制，本研究選擇人肝細(xì)胞癌作為研究對象，通過AnnexinⅤ-

5、FITC/PI雙染法、透射電鏡觀察、線粒體跨膜電位檢測、和Hoechst33342/免疫熒光染色等試驗(yàn)方法從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度說明ARG可以誘導(dǎo)Hep G2和SMMC7721細(xì)胞的凋亡。而后，采用qPCR、流式細(xì)胞儀和Western blot等試驗(yàn)技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡信號通路及凋亡相關(guān)因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ARG作用于Hep G2細(xì)胞時(shí)，首先會(huì)破壞細(xì)胞線粒體的氧化還原功能，同時(shí)使NADPH酶和細(xì)胞色素P450酶參與的代謝過程發(fā)生異常，從

6、而導(dǎo)致細(xì)胞中ROS水平升高。在ROS的影響下，MAPK信號通路中JNK和p38被激活，兩者共同促進(jìn)了Hep G2細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的活化，于此同時(shí)，p38參與激活其外源性凋亡途徑并上調(diào)p53的表達(dá)。最終，在兩條凋亡途徑共同作用下，細(xì)胞中的caspase蛋白群被激活，從而介導(dǎo)了Hep G2凋亡的發(fā)生。此外，ARG還可以抑制Hep G2細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)移和PI3K/Akt信號通路的激活。上述結(jié)果表明ARG是一種“多靶點(diǎn)”化合物，它可以

7、通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　ARG體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制研究:在對裸鼠人肝癌移植瘤進(jìn)行體內(nèi)抑癌作用研究中發(fā)現(xiàn)，ARG對人肝癌移植瘤具有顯著的抑制作用，20 mg/kg ARG對Hep G2移植瘤抑瘤率可達(dá)44.55％。并且?guī)缀醪粫?huì)對荷瘤小鼠的一般狀態(tài)及肝、肺、腎等主要臟器產(chǎn)生不良影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ARG在體內(nèi)抑制腫瘤組織的生長是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。其主要作用機(jī)制是通過上調(diào)p-JNK、p-p38、Bax

8、以及TNF-α的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ARG體內(nèi)抗腫瘤研究說明ARG不僅可以抑制腫瘤的生長，同時(shí)具有低毒的作用特點(diǎn)，此研究結(jié)果為ARG的進(jìn)一步開發(fā)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究發(fā)明建立了一種簡便高效的ARG提取方法，適合于實(shí)驗(yàn)室自行提取制備ARG，并且此方法具有成本低廉、提取純度高、污染少等諸多優(yōu)點(diǎn)。在此基礎(chǔ)之上，本研究對ARG的抗腫瘤作用及其體內(nèi)外作用機(jī)制進(jìn)行了深入探索。研究結(jié)果表明，ARG在體內(nèi)外均具有良好的抗腫瘤作