海參皂苷echinosideA和ds-echinoside A抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、海參皂苷是海參體壁中重要的活性成分之一,具有抗真菌、抗病毒、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性。不同種類(lèi)的海參因生活環(huán)境和攝食不同,其體內(nèi)皂苷含量和結(jié)構(gòu)差別較大。通過(guò)前期篩選發(fā)現(xiàn)一種皂苷含量豐富的海參一革皮氏海參(Pearsonothuria graeffei),其體壁海參皂苷的含量可達(dá)干重的3.514％,可以作為海參皂苷良好的生物來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)利用從革皮氏海參中經(jīng)大孔樹(shù)脂、反復(fù)正反相硅膠柱層析、高效液相分離得到的三萜皂苷化合物ech

2、inoside A(EA)和ds-echinoside A(DSEA)為研究對(duì)象,在體內(nèi)和體外水平系統(tǒng)評(píng)價(jià)了EA和DSEA抗腫瘤活性及其作用機(jī)制,并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步探討。主要研究結(jié)果如下:
　　 采用MTT法對(duì)EA和DSEA的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示,EA和DSEA對(duì)HepG2、B16、Caco-2、Hela、P388、S180等多種腫瘤細(xì)胞有廣泛的增殖抑制活性(P＜0.01),且有明顯的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系。

3、在選用的腫瘤細(xì)胞株中,EA和DSEA對(duì)HepG2細(xì)胞作用最敏感,24h時(shí)IC50值分別為2.49μM和2.46μM。
　　 基于篩選結(jié)果,以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象,采用形態(tài)學(xué)觀察、AO/EB染色法、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)EA和DSEA體外抗腫瘤生長(zhǎng)活性及其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果表明,EA和DSEA均能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,改變腫瘤細(xì)胞周期分布,形成G0/G1期阻滯。RT-PCR結(jié)果顯示,EA和DSEA能顯著下調(diào)Cycli

4、n D1 mRNA表達(dá),提高p16、p21和C-myc mRNA表達(dá)。Western blotting實(shí)驗(yàn)表明EA和DSEA能顯著下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),提高線粒體細(xì)胞色素C的釋放量,上調(diào)Caspase-3和PARP剪切體的表達(dá)量。對(duì)于NF-κB,DSEA能顯著降低其蛋白的表達(dá),但EA對(duì)其表達(dá)無(wú)顯著影響。提示EA和DSEA具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性,其作用機(jī)制與抑制Cyclin D1/CDK結(jié)合,阻滯細(xì)胞周期,并通過(guò)線粒體信號(hào)通路啟

5、動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　 比較研究了EA和DSEA抗HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性及其作用機(jī)制。結(jié)果表明,EA和DSEA均可顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移(P＜0.05,P＜0.01)、粘附(P＜0.05,P＜0.01)和侵襲能力(P＜0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,EA和DSEA均可下調(diào)MMP-9并提高TIMP-1的表達(dá)。Western blotting結(jié)果表明,EA和DSEA均可顯著下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)。提示EA和DSEA可通過(guò)調(diào)

6、控MMP-9信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
　　 為深入探討EA和DSEA抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用及其機(jī)制,進(jìn)一步選用高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株.人肺巨細(xì)胞癌95D為研究對(duì)象,比較研究了EA和DSEA對(duì)95D細(xì)胞遷移、粘附、侵襲和血管新生各環(huán)節(jié)的作用及其機(jī)制。結(jié)果表明,EA和DSEA能顯著降低95D細(xì)胞遷移(P＜0.01)、侵襲(P＜0.01)以及粘附能力(P＜0.05,P＜0.01);還能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,抑制內(nèi)皮細(xì)

7、胞小管的形成和Chicken Chorioallantoic Membrane(CAM)上的血管新生。RT-PCR結(jié)果顯示,EA和DSEA能顯著降低uPA、MMP-2/-9和VEGF的表達(dá),同時(shí)還能顯著上調(diào)TIMP-1/-2的表達(dá)。對(duì)于NF-κB,DSEA能顯著降低其mRNA的表達(dá),但EA對(duì)其表達(dá)無(wú)顯著影響。提示EA和DSEA可通過(guò)調(diào)控uPA信號(hào)通路,保護(hù)ECM結(jié)構(gòu),減少VEGF的釋放,從而抑制95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
　　 通過(guò)建立小

8、鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型和B16人工肺轉(zhuǎn)移模型,在整體水平驗(yàn)證EA和DSEA的抗腫瘤作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示,EA和DSEA能顯著抑制Lewis肺癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移,上調(diào)Caspas-3的表達(dá),下調(diào)HPA、MMPs和VEGF的表達(dá)。提示EA和DSEA可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,降低ECM降解酶的活力,減少VEGF的釋放,抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。B16人工肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示,EA和DSEA能顯著減少B

9、16肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目,降低血清中SA含量和γ-GT活力以及肺組織中羥脯氨酸、氨基己糖和糖醛酸含量,抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖活性和運(yùn)動(dòng)性,從而顯著的抑制腫瘤細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)引發(fā)的轉(zhuǎn)移。
　　 EA和DSEA均屬于具有9(11)位雙鍵和12,17位羥基取代的海參烷型三萜皂苷,其苷元部分結(jié)構(gòu)完全相同,僅在糖鏈部分略有差別。EA在木糖(Xyl)的C-4位上有硫酸酯基取代,而DSEA則在Xyl C-4發(fā)生了脫硫酸酯基的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,D