牛蒡子苷元誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)研究鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) CNE-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)處理后，檢測(cè)ARG對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活力的影響及細(xì)胞凋亡率的變化，并對(duì)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路mRNA和蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)量，研究討論ARG對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡的影響及其分子作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配制
　　鼻咽癌CNE

2、-1細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液中，并將細(xì)胞置于37℃、5％ CO2、95％濕度培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞按照1∶3傳代，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后取指數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用RPMI1640培養(yǎng)液將牛蒡子苷元調(diào)配至所需藥物濃度（10μmol/L、20μmol/L、40mol/L、80μmol/L）。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組用加入不含牛蒡子苷元的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的牛蒡子苷元進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞活力及凋亡

3、率等生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化
　　經(jīng)不同濃度的ARG處理CNE-1細(xì)胞后，運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞活力的影響。
　　3、Caspase-3及caspase-9活性檢測(cè)
　　培養(yǎng)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞，經(jīng)不同濃度藥物處理后運(yùn)用Caspase-3及caspase-9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CNE-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前后caspase-3及caspase-9活性的變化
　　

4、4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率
　　取指數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，經(jīng)藥物作用后，依據(jù)AnnexinⅤ—FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)闡述步驟逐步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞并運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞凋亡變化情況。
　　5、Real-time PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)
　　提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA后，利用Real-time PCR法實(shí)驗(yàn)法分別檢測(cè)PI3K、AKT、XIAP mRNA表達(dá)量。
　　6、

5、Western blot檢測(cè)各蛋白表達(dá)情況
　　對(duì)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行提取，使用Western blotting法來(lái)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染牛蒡子苷元處理CNE-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前后PI3K、AKT、XIAP信號(hào)通路蛋白表達(dá)量。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，組間采用SNK-q檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表明數(shù)據(jù)具有

6、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞活力的影響
　　CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度ARG(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)處理CNE-1細(xì)胞后，作用24h各組細(xì)胞活力抑制率分別為4.35％、13.22％、23.37％、39.94％;作用48h各組細(xì)胞活力抑制率分別為24.82％、44.47％、61.73％、83.11％;作用72h各組細(xì)胞活力

7、抑制率分別為46.43％、68.46％、87.18％、94.16％。以上結(jié)果表明當(dāng)ARG濃度為10μmol/L即可抑制細(xì)胞活力，當(dāng)ARG濃度達(dá)80μmol/L時(shí)的細(xì)胞抑制率顯著增加;且各濃度ARG處理CNE-1細(xì)胞的抑制率與作用時(shí)間呈正相關(guān)，且利用SPSS計(jì)算經(jīng)ARG處理24 h的IC50為23.51μmol/L。
　　2、ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡率的影響
　　運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析得出，CNE-1細(xì)胞經(jīng)0、10、20μmol

8、/L濃度的ARG處理后，凋亡率分別為1.46％、15.4％、25.7％，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)
　　3、ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞caspase-3及caspase-9活性的影響
　　經(jīng)10μmol/L、20μmol/L ARG處理CNE-1細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞的caspase-3活性分別為1.59±0.08、5.31±0.34;caspase-9活性分別為

9、1.34±0.11、3.55±0.27。結(jié)果顯示ARG可上調(diào)caspase-3及caspase-9的活性，且與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)
　　4、ARG對(duì)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響
　　10μmol/L ARG組PI3K、AKT及XIAP對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.78±0.02、0.90±0.03、0.79±0.03;20μmol/L ARG組分別為0.60±0.02、0.7

10、2±0.01、0.55±0.04。說(shuō)明ARG可下調(diào)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路mRNA的表達(dá)
　　5、ARG對(duì)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響
　　10μmol/L ARG組PI3K、AKT、p-AKT、XIAP蛋白水平分別為0.85±0.04、0.81±0.01、0.45±0.02及0.78±0.03;20μmol/L ARG組各成員的蛋白水平分別為0.38±0.02、0.66±0.01、0.19±0

11、.02及0.23±0.02。10μmol/L、20μmol/L ARG處理CNE-1細(xì)胞后PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組均出現(xiàn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、隨濃度和時(shí)間的增加，ARG可顯著抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的細(xì)胞活力(P＜0.01)。
　　2、AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻咽癌CNE-1細(xì)胞經(jīng)ARG處理后，細(xì)胞凋亡率顯著增

12、加，并且與藥物作用濃度呈正相關(guān)性。
　　3、Caspase-3及caspase-9活性的增加及細(xì)胞凋亡率的升高表明ARG可顯著促進(jìn)CNE-1細(xì)胞的凋亡。
　　4、實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞經(jīng)ARG處理后，與對(duì)照組相比，PI3K、AKT、XIAP mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01);同時(shí)ARG可明顯下調(diào)PI3K、AKT、p-AKT、XIAP各蛋白水平(P＜0.05)。以上結(jié)果提示ARG可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)