牛蒡子苷元增強非小細胞肺癌藥物敏感性的機制研究.pdf

1、目的:非小細胞肺癌(NSCLC)是一種常見的惡性腫瘤，是全球因癌死亡的重要原因。盡管對NSCLC的治療已取得一定進展，但效果仍不盡如人意，5年總生存率不足20％。不同抗癌藥物的聯(lián)合治療對克服化療耐藥性，提高患者生存具有重要意義。牛蒡子苷元主要來源于傳統(tǒng)中藥牛蒡子，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)的一個重要成員，調控細胞生存和增殖。大量研究表明，Survivin基因高表達是腫瘤細胞耐藥性的一個重

2、要機制。本研究旨在探討牛蒡子苷元對NSCLC順鉑敏感性的增強作用和Survivin基因在牛蒡子苷元促進肺癌細胞敏感性中的作用。
　　方法:
　　1.對人肺癌細胞H460進行細胞培養(yǎng)后，分別應用不同濃度的牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑進行藥物處理。
　　2.在細胞增殖實驗中，人肺癌細胞H460分別應用1-20μM不同濃度的牛蒡子苷元處理72小時，然后收集細胞檢測細胞活性。在細胞凋亡和細胞周期實驗中，H460細胞應用10μM牛蒡

3、子苷元處理48小時，然后收集細胞，分析細胞凋亡和細胞周期分布變化。在牛蒡子苷元聯(lián)合順鉑處理時，H460細胞與10μM牛蒡子苷元和2或10μM順鉑共同孵育48小時，然后收集細胞分析細胞活性、細胞凋亡或細胞周期。
　　3.應用MTT法測定牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑對H460細胞的影響。應用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。應用碘化丙錠(PI)染色法結合流式細胞術檢測細胞周期分布情況。應用蛋白免疫印跡法檢測切割型Casp

4、ase-3和切割型PARP的表達水平。
　　4.應用RT-PCR技術從H460細胞中擴增全長人Survivin cDNA，并將其克隆至pcDNA3.1(+)表達載體，構建人Survivin基因真核表達質粒。將pcDNA3.1-Survivin重組質?；蚩蛰d體分別轉染H460細胞，孵育24 h后，應用Western blot法檢測Survivin過表達情況;轉染細胞與牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑處理，應用AnnexinⅤ-FITC/PI

5、染色法檢測細胞凋亡情況。
　　5.應用SPSS11.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，每個實驗重復做3次，各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用Tukey post hoc檢驗，檢驗水準為α=0.05。
　　結果:
　　1.與對照細胞相比較，牛蒡子苷元處理可顯著抑制H460細胞增殖，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。當應用牛蒡子苷元10μM處理H460細胞時，H460細胞增殖活性

6、被抑制約50％。順鉑的濃度為2和10μM時分別可抑制H460細胞增殖28％和65％。牛蒡子苷元在10μM時可顯著增強順鉑介導的抑制H460細胞增殖。
　　2.牛蒡子苷元處理后顯著誘導H460細胞凋亡發(fā)生，凋亡率為9.5±2.0％，顯著高于對照組的2.7±1.2％。較對照細胞，牛蒡子苷元處理H460細胞具有更好水平的切割型caspase-3和PARP。2和10μM順鉑處理H460細胞48小時后分別誘導8.4±1.9％和15.6±2.

7、3％細胞發(fā)生凋亡。當2μM順鉑和10μM牛蒡子苷元聯(lián)合后，H460細胞發(fā)生凋亡的比率增加為27.2±3.1％，這表明牛蒡子苷元可增強順鉑對H460細胞凋亡的誘導作用。
　　3.2μM順鉑處理H460細胞后并不能改變細胞周期分布。而10μM牛蒡子苷元處理后可導致H460細胞G1期細胞數(shù)顯著增加而S期和G2/M期細胞數(shù)顯著下降。當順鉑與牛蒡子苷元聯(lián)合處理時，H460細胞G1期細胞同樣顯著增加，S期和G2/M期顯著降低。
　　4.

8、與未轉染和轉染空載體質粒的H460細胞相比，轉染pcDNA3.1-Survivin重組質粒H460細胞Survivin水平顯著增加，提高大約10倍。低劑量順鉑對H460細胞Survivin蛋白表達影響不顯著，而牛蒡子苷元可顯著抑制Survivin蛋白表達水平。當牛蒡子苷元與順鉑聯(lián)合作用時，Survivin蛋白表達抑制程度更大。與轉染空載體質粒相比，轉染Survivin表達重組質粒的細胞對牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑誘導的凋亡具有抗性，細胞凋

9、亡比率顯著下降。
　　結論:
　　1.牛蒡子苷元抑制H460肺癌細胞生長。
　　2.牛蒡子苷元抑制H460肺癌細胞生長活性與誘導細胞凋亡和G0/G1期細胞周期停滯有關。
　　3.牛蒡子苷元增強順鉑對H460細胞凋亡的誘導作用。因而，牛蒡子苷元可能在基于鉑制劑抗NSCLC治療中有臨床應用價值。
　　4.牛蒡子苷元抑制H460肺癌細胞中Survivin基因表達，牛蒡子苷元促H460肺癌細胞順鉑敏感性與抑制Sur