牛蒡子苷元增強非小細(xì)胞肺癌藥物敏感性的機制研究.pdf

1、目的:非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是一種常見的惡性腫瘤，是全球因癌死亡的重要原因。盡管對NSCLC的治療已取得一定進(jìn)展，但效果仍不盡如人意，5年總生存率不足20％。不同抗癌藥物的聯(lián)合治療對克服化療耐藥性，提高患者生存具有重要意義。牛蒡子苷元主要來源于傳統(tǒng)中藥牛蒡子，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)的一個重要成員，調(diào)控細(xì)胞生存和增殖。大量研究表明，Survivin基因高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞耐藥性的一個重

2、要機制。本研究旨在探討牛蒡子苷元對NSCLC順鉑敏感性的增強作用和Survivin基因在牛蒡子苷元促進(jìn)肺癌細(xì)胞敏感性中的作用。
　　方法:
　　1.對人肺癌細(xì)胞H460進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，分別應(yīng)用不同濃度的牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑進(jìn)行藥物處理。
　　2.在細(xì)胞增殖實驗中，人肺癌細(xì)胞H460分別應(yīng)用1-20μM不同濃度的牛蒡子苷元處理72小時，然后收集細(xì)胞檢測細(xì)胞活性。在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期實驗中，H460細(xì)胞應(yīng)用10μM牛蒡

3、子苷元處理48小時，然后收集細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布變化。在牛蒡子苷元聯(lián)合順鉑處理時，H460細(xì)胞與10μM牛蒡子苷元和2或10μM順鉑共同孵育48小時，然后收集細(xì)胞分析細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期。
　　3.應(yīng)用MTT法測定牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑對H460細(xì)胞的影響。應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。應(yīng)用碘化丙錠(PI)染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況。應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測切割型Casp

4、ase-3和切割型PARP的表達(dá)水平。
　　4.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從H460細(xì)胞中擴增全長人Survivin cDNA，并將其克隆至pcDNA3.1(+)表達(dá)載體，構(gòu)建人Survivin基因真核表達(dá)質(zhì)粒。將pcDNA3.1-Survivin重組質(zhì)粒或空載體分別轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞，孵育24 h后，應(yīng)用Western blot法檢測Survivin過表達(dá)情況;轉(zhuǎn)染細(xì)胞與牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑處理，應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI

5、染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　5.應(yīng)用SPSS11.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個實驗重復(fù)做3次，各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用Tukey post hoc檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.與對照細(xì)胞相比較，牛蒡子苷元處理可顯著抑制H460細(xì)胞增殖，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。當(dāng)應(yīng)用牛蒡子苷元10μM處理H460細(xì)胞時，H460細(xì)胞增殖活性

6、被抑制約50％。順鉑的濃度為2和10μM時分別可抑制H460細(xì)胞增殖28％和65％。牛蒡子苷元在10μM時可顯著增強順鉑介導(dǎo)的抑制H460細(xì)胞增殖。
　　2.牛蒡子苷元處理后顯著誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡發(fā)生，凋亡率為9.5±2.0％，顯著高于對照組的2.7±1.2％。較對照細(xì)胞，牛蒡子苷元處理H460細(xì)胞具有更好水平的切割型caspase-3和PARP。2和10μM順鉑處理H460細(xì)胞48小時后分別誘導(dǎo)8.4±1.9％和15.6±2.

7、3％細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)2μM順鉑和10μM牛蒡子苷元聯(lián)合后，H460細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率增加為27.2±3.1％，這表明牛蒡子苷元可增強順鉑對H460細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　3.2μM順鉑處理H460細(xì)胞后并不能改變細(xì)胞周期分布。而10μM牛蒡子苷元處理后可導(dǎo)致H460細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加而S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著下降。當(dāng)順鉑與牛蒡子苷元聯(lián)合處理時，H460細(xì)胞G1期細(xì)胞同樣顯著增加，S期和G2/M期顯著降低。
　　4.

8、與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的H460細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Survivin重組質(zhì)粒H460細(xì)胞Survivin水平顯著增加，提高大約10倍。低劑量順鉑對H460細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)影響不顯著，而牛蒡子苷元可顯著抑制Survivin蛋白表達(dá)水平。當(dāng)牛蒡子苷元與順鉑聯(lián)合作用時，Survivin蛋白表達(dá)抑制程度更大。與轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染Survivin表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞對牛蒡子苷元單獨或聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)的凋亡具有抗性，細(xì)胞凋

9、亡比率顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1.牛蒡子苷元抑制H460肺癌細(xì)胞生長。
　　2.牛蒡子苷元抑制H460肺癌細(xì)胞生長活性與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1期細(xì)胞周期停滯有關(guān)。
　　3.牛蒡子苷元增強順鉑對H460細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。因而，牛蒡子苷元可能在基于鉑制劑抗NSCLC治療中有臨床應(yīng)用價值。
　　4.牛蒡子苷元抑制H460肺癌細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)，牛蒡子苷元促H460肺癌細(xì)胞順鉑敏感性與抑制Sur