hMOF調(diào)控非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為及放射敏感性的研究.pdf

1、目的:近幾年來(lái)，肺癌的發(fā)病率及病死率均呈逐漸上升趨勢(shì)，是癌癥相關(guān)性死亡的首要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有80％的肺癌患者的病理類(lèi)型是非小細(xì)胞肺癌(non smallcell lung cancer，NSCLC)，大約70％的非小細(xì)胞肺癌患者在腫瘤治療期間接受了放射治療，腫瘤細(xì)胞放射敏感性在NSCLC的放療療效中起著重要的作用。因此，從分子水平深入認(rèn)識(shí)肺癌的發(fā)生過(guò)程，篩選出獲得與肺癌發(fā)生發(fā)展及放療敏感性相關(guān)的功能性基因，為分子靶向治療提供新的靶點(diǎn)及

2、理論依據(jù)，對(duì)于肺癌的放射治療具有重要意義。
　　組蛋白的乙?；欣诤诵◇w結(jié)構(gòu)松弛，從而暴露出DNA特異性結(jié)合位點(diǎn)，以利于各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。而組蛋白的去乙酰化則發(fā)揮相反的作用。hMOF(human males absent on the first)作為乙酰化組蛋白H4K16的關(guān)鍵酶，參與了許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，在細(xì)胞內(nèi)的功能具有多樣性和廣泛性。實(shí)驗(yàn)研究證明，沉默hMOF之后引起H4K16ac的減少

3、，可引起基因轉(zhuǎn)錄的異常，基因組不穩(wěn)定，自發(fā)的染色體畸變，細(xì)胞周期功能缺陷和形態(tài)的改變，及致癌基因或抑癌基因的異常表達(dá)，最近研究發(fā)現(xiàn)hMOF在乙?；M蛋白的同時(shí)，也與非組蛋白的乙?；嘘P(guān)，如P53、Nrf2等蛋白的乙?；?，從而參與到細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)的過(guò)程中來(lái)。DNA是電離輻射的主要靶分子，DNA損傷修復(fù)能力的水平是影響放射敏感性的重要因素。在分子腫瘤學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，與DNA修復(fù)功能相關(guān)的基因突變、多態(tài)性及表觀修飾均可引起細(xì)胞放

4、射敏感性的改變。目前對(duì)于hMOF在Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌放療患者中的表達(dá)情況對(duì)預(yù)后的影響，及hMOF的表達(dá)是否能夠影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性，至今沒(méi)有研究報(bào)道。
　　研究方法:1、收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切非小細(xì)胞肺癌組織及其配對(duì)正常肺組織24例，提取RNA及蛋白，采用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測(cè)分析肺癌組織及其正常肺組織中hMOF的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。收集90例接受根治性放射治療的Ⅲ期

5、非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本（纖支鏡或者介入下穿刺取得的癌組織）。利用免疫組化檢測(cè)hMOF在Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，分析hMOF的表達(dá)情況與臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性。2、采用Westernblot方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460、A549、H1299細(xì)胞系中hMOF蛋白的內(nèi)源性表達(dá)情況。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299和A549細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默hMOF的細(xì)胞。采用Western blot方法

6、檢測(cè)轉(zhuǎn)染后以上兩種細(xì)胞表達(dá)hMOF基因編碼蛋白情況。采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)hMOF基因?qū)SCLC細(xì)胞系H1299和A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。采用MTT法評(píng)估沉默hMOF對(duì)NSCLC細(xì)胞系H1299和A549細(xì)胞增殖活性的影響。通過(guò)裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)估沉默hMOF的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299體內(nèi)增殖能力。采用Western blot方法評(píng)價(jià)hMOF基因?qū)kt信號(hào)通路的影響。3、采用平板克隆形

7、成實(shí)驗(yàn)評(píng)估hMOF基因?qū)?xì)胞放射敏感性的影響;通過(guò)多靶單擊模型繪制存活曲線(xiàn)，計(jì)算D0、Dq、SER等放射敏感性相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)沉默hMOF后對(duì)NSCLC細(xì)胞系H1299、A549細(xì)胞的增敏效果;通過(guò)Western blot方法評(píng)價(jià)hMOF基因沉默對(duì)p-ATM及RAD51蛋白的影響。4、實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水平F=0.05，2組計(jì)量資料采用t檢

8、驗(yàn)或t'檢驗(yàn)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水平α=0.05，計(jì)數(shù)資料采用行×列表的x2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。
　　結(jié)果:1、通過(guò)Realtime-PCR、Western Blot方法對(duì)24例非小細(xì)胞肺癌組織及配對(duì)正常肺組織中hMOF表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hMOF蛋白在NSCLC組織中的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于配對(duì)正常肺組織，P＜0.05。2、90例Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌放療患者的肺癌組織病理切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，發(fā)

9、現(xiàn)有46例為hMOF高表達(dá)。hMOF的表達(dá)情況與腫瘤的N分期情況具有相關(guān)性。經(jīng)過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)hMOF低表達(dá)患者的中位生存期為28個(gè)月，5年生存率22.9％。hMOF高表達(dá)患者中位生存期為20個(gè)月，5年生存率5.4％。與未接受同步放化療的患者相比，接受同步放化療患者的中位生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，1年、3年、5年生存率顯著升高，P＜0.05。hMOF的表達(dá)情況、放化療情況以及N分期情況是Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌放療患者的獨(dú)立預(yù)后因素，對(duì)預(yù)后的相對(duì)危險(xiǎn)度分

10、別為hMOF的表達(dá)情況:1.811，放化療情況:1.968，N分期:1.799。3、通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默hMOF基因可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活性，通過(guò)Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默hMOF基因抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲。裸小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，hMOF基因沉默后可抑制非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)，P＜0.05。4、沉默hMOF下調(diào)了p-AKT的表達(dá)。5、根據(jù)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步擬合劑量存活

11、曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)沉默hMOF能后夠提高H1299和A549的放射敏感性，增敏比分別為1.22和1.34。6、通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示與空載組相比，沉默hMOF基因后p-ATM及RAD51表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論:1、與正常肺組織相比，NSCLC組織中hMOF的mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高。Ⅲ期NSCLC放療患者的hMOF表達(dá)情況與預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)者預(yù)后差。接受同步放化療的患者較未接受同步放化療的患者預(yù)后好。hMOF的表達(dá)