沉默DNA-PKcs、ATM表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為及放療敏感性的影響.pdf

1、研究背景：
　　宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率在女性所有惡性腫瘤中居第4位，但是在部分發(fā)展中國(guó)家，由于宮頸癌篩查不到位，其發(fā)病率可以居女性惡性腫瘤首位。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年約有新發(fā)宮頸癌患者528,000例，因?qū)m頸癌導(dǎo)致的死亡約為266,000例，其中85％左右發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。宮頸癌是唯一明確病因的惡性腫瘤，持續(xù)的高危HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的原因，其中HPV16/18兩種病毒感染導(dǎo)致的宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的80%左右。
　　

2、目前宮頸癌的治療主要包括手術(shù)、放療和化療。放療是宮頸癌的重要治療方法，特別對(duì)晚期宮頸癌患者。放射線(xiàn)能引起細(xì)胞DNA雙鏈斷裂（DSB），如果不能及時(shí)修復(fù)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞中存在著對(duì)其存活至關(guān)重要的DNA損傷修復(fù)通路。腫瘤細(xì)胞對(duì)放療導(dǎo)致DNA損傷的修復(fù)能力是引起其對(duì)放療不敏感的重要原因。目前較為公認(rèn)的DSB修復(fù)機(jī)制主要有兩種：非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞以NHEJ修復(fù)為主。DNA-PKcs和ATM分別

3、在NHEJ和HR修復(fù)中起重要作用。
　　臨床研究表明DNA-PKcs和ATM高表達(dá)的腫瘤患者疾病進(jìn)展較快，對(duì)放療不敏感，預(yù)后較差。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)RNA干擾抑制癌細(xì)胞DNA-PKcs或ATM的表達(dá)能增加其對(duì)放療的敏感性，并且對(duì)其部分惡性生物學(xué)行為有一定影響。但是還沒(méi)有研究同時(shí)抑制DNA-PKcs和ATM表達(dá)檢測(cè)其對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及放療敏感性的影響。
　　研究目的：
　　探討抑制HeLa細(xì)胞DNA-PKcs、

4、ATM的表達(dá)后，對(duì)其生物學(xué)行為及放療敏感性的影響。
　　材料與方法：
　　1.構(gòu)建干擾質(zhì)粒：將針對(duì)DNA-PKcs和ATM的干擾RNA分別及同時(shí)連入質(zhì)粒，合成含針對(duì)DNA-PKcs、ATM及DNA-PKcs+ATM的干擾質(zhì)粒。
　　2.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株及檢測(cè)沉默效果：將干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞，嘌吟霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。用Western Blot和Quantitative Real-time PCR檢測(cè)

5、未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞組（對(duì)照組），轉(zhuǎn)染干擾DNA-PKcs表達(dá)HeLa細(xì)胞組（DNA-PKcs組），轉(zhuǎn)染干擾ATM表達(dá)HeLa細(xì)胞組（ATM組）和轉(zhuǎn)染同時(shí)干擾DNA-PKcs+ATM表達(dá)HeLa細(xì)胞組（DNA-PKcs+ATM組）的DNA-PKcs和ATM蛋白和mRNA表達(dá)水平，檢測(cè)沉默效果。
　　3. CCK8檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默DNA-PKcs、ATM對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活性的影響。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、單

6、獨(dú)及同時(shí)沉默DNA-PKcs、ATM對(duì) HeLa細(xì)胞凋亡的影響。
　　5. Transwell小室侵襲模型檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默DNA-PKcs、ATM對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　6.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默 DNA-PKcs、ATM對(duì) HeLa細(xì)胞放療敏感性的影響。
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性條件的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)

7、準(zhǔn)差（x±S）表示，各組間比較采用方差分析或者非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較用SNK（Student-Newman-Keuls，SNK）法。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系及對(duì)沉默效果的檢測(cè)：使用含嘌呤霉素的梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，確定嘌呤霉素對(duì)HeLa細(xì)胞的最佳篩選濃度為0.8ug/ml。然后用此濃度的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。通

8、過(guò)Western Blot和Quantitative Real-time PCR分別從蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)各組細(xì)胞中 DNA-PKcs和ATM量的變化，結(jié)果顯示：DNA-PKcs組和ATM+DNA-PKcs組的DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均較其它組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；ATM組和DNA-PKcs+ATM組ATM蛋白和mRNA均較其它組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

9、結(jié)果顯示：在24 h、48 h、72 h、96 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ATM+DNA-PKcs組增殖活性較對(duì)照組低，差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在48 h、72 h、96 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，ATM+DNA-PKcs組增殖活性較ATM組低，DNA-PKcs組較對(duì)照組增殖活性低，差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在72 h、96 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組增殖活性低，ATM組較對(duì)照組增殖活性低，差異均

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；在96h時(shí)，DNA-PKcs組較ATM組增殖活性低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組、ATM組及對(duì)照組凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DNA-PKcs組較ATM組和對(duì)照組凋亡增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4. Trans

11、well小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組穿過(guò)基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)少，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中ATM+DNA-PKcs組的穿過(guò)基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)最少；ATM+DNA-PKcs組較ATM組和DNA-PKcs組穿過(guò)基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　5.放療敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在2，4，6 Gy三個(gè)放射線(xiàn)劑量時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組克隆形成率低，且ATM+DNA-PKcs組較DNA

12、-PKcs組和ATM組克隆形成率低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在6Gy時(shí)DNA-PKcs組較ATM組克隆形成率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. DNA-PKcs對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響較ATM明顯。
　　2.同時(shí)沉默宮頸癌 HeLa細(xì)胞 DNA-PKcs和ATM表達(dá)較單獨(dú)沉默DNA-PKcs或ATM，能更有效的增加HeLa細(xì)胞凋